新型原位聚合酶鏈反應(yīng)在檢測肝組織中HBV cccDNA的臨床應(yīng)用價(jià)值研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是呈世界性流行,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球大概有3.5億 HBV攜帶者,其中約有10％發(fā)展為慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)進(jìn)而發(fā)展為肝硬化、肝衰竭以及原發(fā)性肝癌等嚴(yán)重的并發(fā)癥,每年約有28萬人死于HBV感染相關(guān)性疾病[1]。
　　HBV cccDNA又稱乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA,是HBVDNA復(fù)制的中間體,亦是HBV前基因RNA

2、復(fù)制的模板,只有徹底清除HBV cccDNA,才能真正清除乙肝病毒,因此HBV cccDNA的檢測對研究乙型肝炎致病機(jī)制和評價(jià)抗病毒藥物的療效及新藥的研發(fā)等方面具有重要的意義。利用PSAD(質(zhì)粒安全ATP依賴DNA酶)消化、原位滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)等方法進(jìn)行原位 PCR檢測肝組織中的 HBV cccDNA是目前來說較新的一種原位 PCR方法,與液相PCR相比不需從肝組織中提取DNA只需在組織切片上即可進(jìn)行原位擴(kuò)增,與southern相比,

3、不需要電泳、轉(zhuǎn)膜等一系列復(fù)雜的操作步驟,與原位雜交相比,可以將低拷貝的HBV cccDNA通過擴(kuò)增檢測出來,與傳統(tǒng)的一步原位PCR方法相比較,由于經(jīng)過PSAD消化處理去除了非cccDNA的影響以及原位RCA只擴(kuò)增cccDNA,再加上特異性標(biāo)記跨的缺口引物擴(kuò)增,使敏感性和特異性均得到了提高,而且還可以在分子水平上將組織形態(tài)與基因定位、分布狀態(tài)較好地聯(lián)系起來,還可進(jìn)一步了解HBVDNA的復(fù)制能力,不但可以為臨床抗病毒治療提供指導(dǎo),而且為乙型

4、肝炎的病理學(xué)研究提供了適宜的手段。
　　目的:利用新型原位聚合酶鏈反應(yīng)檢測肝組織中的HBV cccDNA,明確 HBV cccDNA在肝組織中的分布狀況,為進(jìn)一步研究 HBV cccDNA在乙型肝炎的致病機(jī)制及探討乙肝治療的新途徑提供分子病理學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、收集30例乙型肝炎、乙肝后肝硬化及肝癌患者的石蠟包埋組織切片,采用同一石蠟包埋肝組織連續(xù)切片進(jìn)行 HE染色,并對染色結(jié)果進(jìn)行炎癥活動度與肝纖維化程度分

5、級分期,并對每一個(gè)石蠟包埋的肝組織進(jìn)行HBsAg和HBcAg免疫組織化學(xué)染色.
　　2、將肝組織切片進(jìn)行防脫及通透化處理后采用PSAD消化,為證明PSAD的作用,我們將切片PSAD消化前后采取同一種擴(kuò)增方法的兩張切片進(jìn)行對比,通過對有無PSAD消化的兩種原位PCR對比,來突出本方法的優(yōu)勢,證明PSAD去除松弛的環(huán)狀HBVDNA及其他形式的DNA,從而增加了檢測的特異性。
　　3、為進(jìn)一步驗(yàn)證滾環(huán)擴(kuò)增的效果,取兩張同一肝組織連

6、續(xù)切片分別進(jìn)行PSAD酶消化后采用半套式原位PCR檢測和滾環(huán)擴(kuò)增加上跨缺口的原位PCR檢測,對兩種方法的圖像結(jié)果進(jìn)行對比分析,評價(jià)兩種方法的敏感性與特異性,從而判斷新型原位PCR方法的敏感性和特異性,探討其應(yīng)用價(jià)值。
　　結(jié)果:
　　1、30例HBV感染患者組織切片病理學(xué)分級、分期為G1-4S0-4,診斷為慢性乙型肝炎23例、肝硬化患者1例,肝癌患者6例;免疫組化HBsAg,陽性為26例,HBcAg,陽性為18例
　　

7、2、應(yīng)用新型原位PCR檢測肝組織中HBV cccDNA,30例組織切片有20例為HBV cccDNA陽性,陽性檢出率67%,組織切片陽性表達(dá)率為平均35%-70%。以核型為主,呈藍(lán)色、紫色或紫藍(lán)色,呈顆粒狀、弧形或圓形團(tuán)塊狀,主要在核及核膜上分布。
　　3、將切片 PSAD消化前后采取同一種擴(kuò)增方法的兩張同一肝組織切片進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)使用 PSAD消化的切片,擴(kuò)增的 HBV cccDNA陽性顆粒較明顯,未使用PSAD消化的肝組織切片上

8、擴(kuò)增的陽性顆粒不明顯,說明 PSAD去除了部分非 cccDNA的干擾,使特異性和敏感性均得到了提高。
　　4、應(yīng)用新型原位PCR檢測肝組織中HBV cccDNA與同一連續(xù)切片的半套式原位PCR方法相比,擴(kuò)增的基因點(diǎn)較集中,顆粒擴(kuò)散范圍較小,因此特異性更高。與傳統(tǒng)的一步原位PCR相比,新型原位PCR能檢測到傳統(tǒng)原位PCR檢測不到的HBV cccDNA陽性顆粒,因此敏感性更強(qiáng)。
　　5、陰性患者及陰性對照肝細(xì)胞胞核為紅色,未見

9、HBVcccDNA陽性顆粒。
　　6、總計(jì)30例檢測患者中,6例慢性乙型肝炎患者、1例酒精性肝硬化合并乙肝肝硬化靜止期的患者、1例肝癌和1例乙肝慢性重癥患者的組織切片中出現(xiàn) HBVcccDNA強(qiáng)陽性信號,慢性乙肝輕型和慢性乙肝中度患者組織細(xì)胞陽性表達(dá)率明顯低于乙肝慢性重癥、肝硬化和肝癌病。
　　7、 HBcAg陽性的肝組織切片檢測HBV cccDNA結(jié)果均為陽性。
　　8、肝組織中 HBV cccDNA陽性結(jié)果的出現(xiàn)與