慢性乙型肝炎耐藥患者外周血單個核細胞HVB cccDNA耐藥相關基因突變特點研究.pdf

1、已有研究支持乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)存在感染患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMcs)等肝外組織的現(xiàn)象，并且在其中檢測到乙型肝炎病毒抗原及HBV DNA的復制。HBV共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)作為HBV基因組的原始復制模板，是HBV持續(xù)感染的關鍵因素。HBV的病毒學特性是影

2、響其感染轉歸和抗病毒療效的最根本的原因，HBV cccDNA雖然量少，但十分穩(wěn)定，是HBV慢性感染以及抗病毒藥物停用后病情反復的主要因素。所以對ccoDNA的檢測便成為了解HBV能否在體內繼續(xù)復制的重要環(huán)節(jié)，國內外學者設計和建立了一些HBV cccDNA的檢測方法，通過各種PCR技術、滾環(huán)擴增(rolling circle amplification，RcA)等實驗室手段能夠對PBMcs中的cccDNA進行定性及定量檢測。
　　近

3、年核苷(酸)類抗病毒藥物的廣泛長期使用帶來了棘手的耐藥問題，已成為臨床抗病毒療效欠佳或失敗的主要原因。關于臨床上經核苷(酸)類似物治療并產生耐藥突變的慢性乙型肝炎患者PBMCs中HBV cccDNA是否同樣存在類似的耐藥突變特點及其是否具有復制潛能，尚未見相關研究報道。本研究利用核苷(酸)類藥物選擇作用下產生的特定耐藥突變作為分子標簽，重點比較分析了樣本血清HBV DNA和PBMCs HBV cccDNA RT區(qū)耐藥相關突變的差異以及對

4、PBMCs中HBVcccDNA復制力進行測定，研究結果將有助于理解HBV肝外感染及耐藥相關機制。
　　目的分析經核苷(酸)類似物抗病毒治療并已在血清病毒中產生耐藥突變的慢性乙型肝炎患者PBMCs中HBV cccDNA的基因突變特點及其是否具有復制表達能力。
　　方法檢測分析了30例慢性乙型肝炎患者，均經6個月以上的核苷(酸)類似物抗病毒治療并已在血清中產生耐藥突變。采集與血清檢測同一時間點的全血標本30例并分離PBMCs，提

5、取總DNA，以不降解質粒的ATP依賴的DNA酶(Plasmid-SafeTMATP-dependent DNase，PSAD)消化+滾環(huán)擴增+路缺口PCR方法擴增HBV cccDNA的RT區(qū)，分析rtM204I、rtM204V、rtN236T、rtA181V、rt184、rt202或rt250等多個位點的核苷(酸)類似物耐藥相關突變。另外將擴增的PBMCs中HBV cccDNA全長基因組克隆到pGEM-Teasy載體中，經BspQⅠ/S

6、caⅠ雙酶切釋放的1.0倍HBV cccDNA全長基因組純化后，轉染入HepG2肝癌細胞，72小時后定量檢測HBsAg及核心顆粒DNA，分析PBMCs中HBV cccDNA全長基因組的自然復制力。
　　結果30例樣品中16例檢出HBV cccDNA，檢出率為53.3％，且PBMCs中HBV cccDNA檢出率與HBeAg陽性率、血清ALT水平及血清HBV DNA載量均無顯著相關性。在16例HBV cccDNA檢出者中，B基因型5例

7、，占31.3％；C基因型11例，占68.8％，與用血清HBV檢測分型結果一致；但與血清HBV均檢出耐藥突變不同，16例PBMCs cccDNA中檢出的病毒均是無核苷(酸)類似物耐藥突變的野生株。4例慢性乙肝患者中有3例從PBMCs中成功獲得全長cccDNA基因組的6條克隆進行復制力檢測，通過ELISA法檢測上清HBsAg及實時定量PCR檢測核心顆粒DNA水平，表明其具有復制表達能力。
　　結論經核苷酸類似物抗病毒治療的慢乙肝患者血