Tim-1及Tim-3基因在乙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、乙型肝炎(簡稱乙肝)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的肝臟損害，是我國當(dāng)前流行最廣泛，危害性較嚴(yán)重的一種傳染病。50﹪的肝硬化和70﹪-90﹪的肝癌是由慢性乙型肝炎病毒感染引起的。目前肝炎治療尚無有效手段。因此，深入探討肝炎發(fā)生機制，必將為預(yù)防和控制肝炎的發(fā)生和發(fā)展提供新型治療手段。HBV感染人體后，其引起的肝臟和其他臟器的病變，以及疾病的發(fā)生、發(fā)展，并非病毒本身所致，而是與人體的免疫狀態(tài)有一定的關(guān)系。

2、研究認(rèn)為：HBV感染的多種臨床表現(xiàn)形式和轉(zhuǎn)歸主要取決于機體所產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答的強弱及活躍程度。在機體的細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中，Th細(xì)胞在調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。初始CD4+Th細(xì)胞分化后可產(chǎn)生至少兩種表型與功能不同的效應(yīng)細(xì)胞亞群：Th1與Th2細(xì)胞，它們是免疫調(diào)節(jié)的核心。Th1細(xì)胞主要誘發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，殺傷胞內(nèi)病原體(包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲等)，誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)；Th2細(xì)胞刺激B細(xì)胞增生，產(chǎn)生相應(yīng)抗體，誘發(fā)體液免疫反應(yīng)以清除

3、胞外病原體，防止胞內(nèi)感染的擴(kuò)散。同時，Th1和Th2細(xì)胞之間存在相互拮抗的關(guān)系。在HBV感染的過程中，研究發(fā)現(xiàn)Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子通過直接或間接作用增強NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，特別是CD8+T細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，有利于清除病毒，同時加重肝細(xì)胞的炎癥損傷。反之，Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子將促進(jìn)體液免疫反應(yīng)，并抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答。因而調(diào)控T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，重建Th1/Th2細(xì)胞亞群平衡，有望成為治療病毒性肝炎的有效手段。 Tim(

4、T cell immuglobulin domain and mucin domain)基因編碼的蛋白是一類具有共同基序的跨膜糖蛋白，其基本結(jié)構(gòu)包括一個信號肽、免疫球蛋白樣區(qū)、粘蛋白樣區(qū)、跨膜區(qū)和有磷酸化位點的胞內(nèi)區(qū)。Tim家族位于人染色體5q32.2，共包括3個基因，分別是Tim-1，Tim-3及Tim-4。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Tim家族參與Th細(xì)胞的分化及免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)，在一些自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展及誘導(dǎo)外周免疫耐受和移植耐受中起著重要作用。

5、Tim-1主要表達(dá)在活化的初始T細(xì)胞表面及分化后的Th2細(xì)胞表面，為T細(xì)胞的活化提供協(xié)同信號，并促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌；Tim-3主要表達(dá)在分化后的Th1細(xì)胞表面，負(fù)調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。HBV感染人體的過程中，Tim-1、Tim-3是否參與其中目前尚未見報道。 本研究通過熒光實時定量RT-PCR及半定量RT-PCR檢測乙肝患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood morIOCulear cells，PBMC)

6、Tim-1、Tim-3 mRNA的表達(dá)水平，探討Tim-1、Tim-3表達(dá)與乙肝各臨床指標(biāo)的相關(guān)性，為進(jìn)一步闡明乙肝的發(fā)病機制及Tim家族分子在乙肝發(fā)生中的作用奠定基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性乙肝患者外周血PBMC中Tim-3mRNA的表達(dá)顯著高于慢性乙肝患者(P<0.05)和健康對照者(P<0.01)，慢性乙肝患者外周血PBMC中Tim-1及Tim-3mRNA的表達(dá)均顯著高于健康對照者，且Tim-3 mRNA的表達(dá)與ALT呈正相關(guān)。本研究結(jié)果

7、提示，新型免疫分子Tim-1、Tim-3可能參與了乙肝的發(fā)病和慢性化過程；而且Tim-3有可能成為臨床監(jiān)測慢性乙肝炎癥活動程度的新指標(biāo)。 目的 通過熒光實時定量RT-PCR及半定量RT-PCR分析乙肝患者與健康對照者PBMC中Tim一1、Tim一3在mRNA水平的表達(dá)差異，探討Tim分子在乙肝發(fā)生發(fā)展中的作用，并進(jìn)而為闡明乙型肝炎發(fā)病機制提供新依據(jù)。 材料與方法 1 病例的選擇與標(biāo)本的收集于2005年6月

8、至2005年9月間，從濟(jì)南市傳染病醫(yī)院住院病人隨機采集乙肝患者外周靜脈血，共計63例，年齡在16-69歲之間，平均35歲，其中男性57人，女性6人。所有病例均符合2000年《病毒性肝炎防治方案》診斷分型標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)共分三組：急性乙型肝炎組4例，慢性乙型肝炎組44例，肝硬化組15例。同時，從濟(jì)南市中心醫(yī)院健康查體中心選取性別和年齡相匹配的健康對照組34例，其HBsAg均為陰性，肝功正常。另外取B超診斷單純性脂肪肝病人組9例，其H

9、BsAg均為陰性，肝功正常。 2 方法2．1 熒光實時定量PCR及半定量RT-PCR檢測Tim-1、Tim-3 mRNA表達(dá)從PUBMED數(shù)據(jù)庫下載人Tim-1、Tim-3的cDNA序列，根據(jù)引物設(shè)計原則，應(yīng)用Premier Primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，為避免基因組DNA污染，所設(shè)計引物均跨不同外顯子。通過熒光實時定量RT-PCR及半定量RT-PCR檢測健康對照者與乙肝患者新鮮分離的PBMC中Tim-1、Tim-3 mRN

10、A表達(dá)。 2．2 全自動生化分析儀(7170s)檢測肝臟功能指標(biāo)(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT)ALT檢測均采用酶速率法．在7170s生化分析儀上檢測，結(jié)果以U/L報告。 2．3 美國ABI公司熒光實時定量PCR檢測患者血清乙肝病毒載量 (HBV DNA)2．4統(tǒng)計學(xué)方法：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示。用SAS統(tǒng)計軟件，以O(shè)ne wayANOVA分析各組別之間的差異，各組間的比較采用q檢驗。 結(jié)果 1 熒光實時定量PC

11、R及半定量RT-PCR檢測Tim-1、Tim-3表達(dá)為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，在本實驗研究中，分別采用兩種方法檢測人Tim-1及Tim-3 mRNA表達(dá)，并比較其一致性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增人Tim-1及Tim-3，經(jīng)2﹪瓊脂糖凝膠電泳觀察Tim-1為單一條帶，Tim-3為兩條條帶，分別為全長膜型Tim-3(fTim-3)和可溶性Tim-3(sTim-3)。熒光實時定量PCR分析得到的三種目的基因條帶融解曲線良好，沒有非特異性條

12、帶擴(kuò)增，特異性高。比較兩種分析方法所得結(jié)果，一致性良好。 2 Tim-1、Tjm-3 mRNA在不同臨床類型乙肝患者外周血PBMC中的表達(dá)對63例乙肝患者和34例正常對照標(biāo)本分別進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析，結(jié)果表明：慢性乙肝患者外周血PBMC中Tim-1表達(dá)值為：1.405±0.6307，顯著高于健康對照者(0.8908±0.3881)(t檢驗，P<0.01)，急性乙肝患者Tim-1表達(dá)值為：2.381±1.05，與健康對照者

13、相比無顯著性差異(t檢驗，P=0.20)。(見圖2-1)急性乙肝、慢性乙肝患者外周血PBMC中Tim-3的表達(dá)值分別為1.48±0.6724和1.502±0.7619，顯著高于健康對照者(0.7294±0.6297)(t檢驗，P<0.01和P<0,05)；急性乙肝Tim-3 mRNA的表達(dá)顯著高于慢性乙肝患者Tim-3mRNA的表達(dá)(P<0.05)。(見圖2-2) 3 慢性乙肝患者外周血中Tim-1、Tim-3 mRNA的表達(dá)與丙氨酸氨

14、基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的相關(guān)性分析慢性乙肝患者外周血Tim-1、Tim-3 mRNA的表達(dá)與ALT的相關(guān)性分析表明，Tim-3 mRNA的表達(dá)與ALT呈正相關(guān)，r=0.317，P<0.05；Tim-1mRNA的表達(dá)與ALT無相關(guān)性，r=0.169，P=0.14。 4 慢性乙肝患者外周血中Tim-1、Tim-3 mRNA的表達(dá)與血清中乙肝病毒載量(DNA)的相關(guān)性分析慢性乙肝患者外周血Tim-1、Tim-3與血清中HBV病毒載量的相關(guān)

15、性分析表明，Tim-1 mRNA的表達(dá)與血清中HBV病毒載量具有負(fù)相關(guān)性，r=0.357，P<0.05；Tim-3mRNA的表達(dá)與血清中HBV病毒載量無相關(guān)性。 5 慢性乙肝患者外周血中Tim-1、Tim-3 mRNA的表達(dá)與HBeAg(+)/HBeAg(-)的相關(guān)性HBeAg陽性和HBeAg陰性慢性乙肝的病原學(xué)、流行病學(xué)和臨床特點、預(yù)后及治療策略有很大區(qū)別，因此根據(jù)乙肝患者外周血病毒標(biāo)志物HBeAg將慢性乙肝病人分為兩組，分別

16、分析Tim-1、Tim-3 mRNA在HBeAg(+)組/HBeAg(-)組的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tim-3 mRNA在HBeAg(-)組的表達(dá)顯著高于HBeAg(+)組，P<0.05，而Tim-1mRNA在兩組的表達(dá)差異無顯著性意義。 6 慢性乙肝患者治療前后外周血中Tim-1、Tim-3 mRNA的表達(dá)對比分析在慢性乙肝組病人中，通過分析同一個病人治療前后Tim-1、Tim-3 mRNA的表達(dá)(4組)發(fā)現(xiàn)，治療后伴隨肝功能的改善，