上海地區(qū)PCV2分子流行病學(xué)及PCV2感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的磷酸化蛋白組學(xué)研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine cirovirus type2, PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus diseases, PCVD)的主要病原，嚴(yán)重危害豬群健康的全球性重要的傳染病。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)PCV2感染報(bào)道日益增多，引起人們廣泛的關(guān)注。為了了解上海地區(qū)PCV2流行狀況，我們對(duì)PCV2開(kāi)展了流行病學(xué)調(diào)查，并對(duì)PCV2進(jìn)行了遺傳變異分析。我國(guó)大多數(shù)地區(qū)豬群中PCV2的感染十分普遍，PCV2可能是一種

2、豬場(chǎng)常在病原體，其中PCV2與其他病原體共感染現(xiàn)象非常嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)借助蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化修飾手段先從體外實(shí)驗(yàn)分析 PCV2感染豬肺泡巨噬細(xì)胞系(porcine alveolar macrophage, PAM)后細(xì)胞因子表達(dá)和蛋白質(zhì)組學(xué)變化，探討 PCV2感染誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)理，具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　1. PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查
　　2014年到2015年初期間，從上海浦東、閔行、嘉定、奉賢的所有規(guī)?；i場(chǎng)中的疑似PCV

3、D患病豬群和正常豬群中采集組織樣品，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)方法，分別檢測(cè)PCV1、PCV2。結(jié)果表明，PCV2感染陽(yáng)性率為64.20％，從陽(yáng)性病料中測(cè)序鑒定到10條PCV2序列，對(duì)其ORF2基因進(jìn)行測(cè)序及分子遺傳演化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上海地區(qū)發(fā)病豬群中PCV2d為優(yōu)勢(shì)流行基因型，在同一豬場(chǎng)中同時(shí)存在 PCV2d、PCV2b及PCV2e。表明PCV2不同基因型毒株在豬體內(nèi)存在序列漂

4、移現(xiàn)象。PCV2的 ORF2同源性分析表明，本研究中的10株P(guān)CV2毒株之間同源性為90.3%~99%；10株P(guān)CV2毒株與國(guó)內(nèi)毒株間同源性高達(dá)90.3%~99.3%，與國(guó)外毒株間同源性為90.0%~99.7%。表明國(guó)內(nèi)、外PCV2毒株序列沒(méi)有明顯的地域差異。
　　2. PCV2感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　本文分別利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)和間接免疫熒光技術(shù)(ind

5、irect immunoinfluscent assay, IFA)檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)PCV2的病毒滴度和不同細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β)的mRNA表達(dá)水平，以此為依據(jù)，確定PCV2感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)的早期和晚期時(shí)間點(diǎn)，分別是24 h和60 h。利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and abso

6、lute quantificationI, iTRAQ)定量組學(xué)的方法分別在PCV2感染后的24 h和60 h時(shí)研究磷酸化蛋白質(zhì)的變化。
　　本次研究中,我們鑒定了925獨(dú)特的磷酸化蛋白，24 h和60 h鑒定到692個(gè)和691個(gè)磷酸化蛋白，這些磷酸化蛋白的變化為探究PCV2免疫抑制和致病機(jī)制提供了大量信息。分析磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)PCV2在感染宿主細(xì)胞時(shí)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)自噬，可能是由于Hippo和Notch信號(hào)通路