PCV2分子流行病學(xué)及其感染與JAK-STAT信號(hào)通路相互作用研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus type，PCV)是一種環(huán)狀、無囊膜的單股DNA病毒，它包括豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)兩個(gè)基因型。其中圓環(huán)病毒2型具有致病性，能夠引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征等多種疾病，并可以引起豬的免疫抑制。
　　 2000年我國第一次報(bào)道豬群檢測出PCV2，隨后多個(gè)省市陸續(xù)報(bào)道了PCV2的感染，流行呈現(xiàn)逐漸蔓延的趨勢。該病毒往往與其他病原混合或繼發(fā)感染，給我國養(yǎng)豬

2、業(yè)造成了巨大損失，嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。近年來，各國學(xué)者對(duì)PCV2的病原學(xué)研究和防控技術(shù)研究逐漸深入，但目前PCV2病原學(xué)及流行病學(xué)許多問題仍未解決，該病毒山東省等地的流行規(guī)律、危害，尤其是在2010年以來，經(jīng)過疫苗大面積使用之后的流行規(guī)律還未見報(bào)道。PCV2的致病機(jī)理仍然處于探索階段，PCV2感染引發(fā)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究有助于闡明PCV2的致病機(jī)理。PCV2感染PK-15細(xì)胞中JAK-STAT信號(hào)通路的激活機(jī)制，JAK-STAT信

3、號(hào)通路是如何抑制病毒蛋白表達(dá)和病毒增殖，與病毒的復(fù)制相關(guān)性尚未見報(bào)道;因此，本研究對(duì)山東省PCV2的分子流行病學(xué)情況進(jìn)行了調(diào)查;對(duì)山東分離株和其他PCV2分離株全基因組序列和主要保護(hù)性抗原蛋白序列進(jìn)行了分析，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的PK-15細(xì)胞α-IFN效應(yīng)因子實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法和PCV2病毒含量實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法，并進(jìn)一步研究了JAK-STAT信號(hào)通路與PCV2感染的相互關(guān)系。
　　 以下分三部分論述:

4、
　　 1.山東省豬圓環(huán)病毒2型流行病學(xué)調(diào)查與PCV2毒株分離及其感染增殖特性研究
　　 為了掌握PCV2在山東省豬群中的感染和流行情況，為豬圓環(huán)病毒病的防制提供參考，2010年～2012年對(duì)山東100余家大中型豬場進(jìn)行豬圓環(huán)病毒流行病學(xué)情況調(diào)查，采用PCR技術(shù)和ELISA方法分別對(duì)采集的豬抗凝血和疑似豬圓環(huán)病毒感染病豬的淋巴結(jié)、脾臟、肺臟等臟器樣品進(jìn)行PCV2抗原及抗體檢測。結(jié)果顯示，2010年、2011年、2012年

5、抗體陽性率分別為72.95％、61.85％和59.89％;核酸陽性率分別為34.66％、29.59％、21.38％。
　　 在流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，用PCV2抗原檢測陽性的病料感染PK-15細(xì)胞，獲得2株P(guān)CV2病毒的分離株。將其盲傳20代后病毒滴度為分別為106.0TCID50/ml和106.2TCID50/ml，通過對(duì)其中一株P(guān)CV2 SD-JN株進(jìn)行病毒的生長曲線測定發(fā)現(xiàn)，PCV2在細(xì)胞中生長至第72小時(shí)后，達(dá)到TCID5

6、0的最高峰106.2TCID50/ml。PCV2分離株的獲得，對(duì)進(jìn)行病毒體外增殖特性研究，闡明PCV2與細(xì)胞間的相互作用機(jī)制，進(jìn)一步研制高效優(yōu)質(zhì)的PCV2疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.豬圓環(huán)病毒2型分離株遺傳演化、時(shí)空界定及PCV2b山東株全基因序列分析
　　 為了解山東省PCV2流行株的遺傳變異情況，2010～2012年，本研究從患病豬組織、血樣中擴(kuò)增克隆出PCV2的全基因組序列，獲得8株P(guān)CV2山東株全基因序列，其中P

7、CV2b型為7株。同時(shí)對(duì)2005～2012間本實(shí)驗(yàn)室獲得的26株山東分離株進(jìn)行了核苷酸和主要蛋白氨基酸序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，26株山東PCV2分離株核苷酸同源性為69.9％-100％，其中2006年分離的DQ478947與2010年分離的HM142894同源性最低。應(yīng)用DNA Star分析軟件對(duì)26株山東分離株Rep蛋白氨基酸序列和Cap蛋白氨基酸序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，根據(jù)Cap蛋白第86-89位氨基酸序列為SNPR(L)或者TNKI

8、判斷，26株P(guān)CV2山東分離株中，HM142897、HM142900和SD8-1三株序列第86-89位氨基酸序列為TNKI，為PCV2a亞型，其余的23株均為SNPR(L)，為PCV2b亞型。26株P(guān)CV2 ORF1編碼的314或315個(gè)的氨基酸，ORF2編碼233、234或235個(gè)的氨基酸，Rep蛋白的氨基酸同源性為98.3％-100％，Cap蛋白的氨基酸同源性為83.7％-100％。Rep蛋白上的三個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)24aa-26a

9、a(NPS)，256aa-258aa(NQT)，286aa-288aa(NAT)均沒有變化。Cap蛋白變異較大，主要變異區(qū)位于51aa-78aa,121aa-134aa,169aa-215 aa。
　　 將2005～2012間本實(shí)驗(yàn)室獲得的26株山東分離株與GenBank登錄的國內(nèi)外其他PCV2全基因序列共90株，進(jìn)行核苷酸進(jìn)化樹和ORF2編碼氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果表明，PCV2的流行經(jīng)歷了1998年至2002年以PCV2a亞型為

10、主要流行毒株階段，2003年為PCV2a和PCV2b亞型并存階段，2003年至今以PCV2b為主要流行毒株階段的三個(gè)階段演變過程。PCV2b亞型中國分離毒株在遺傳進(jìn)化上，以秦嶺淮河為界限，按照地域分為了中國南部和中國北部兩個(gè)大的集群。從ORF2進(jìn)化樹分析看出，26株山東分離株中，24株的ORF2基因集中分布于進(jìn)化樹兩端的兩個(gè)大分支上，其中9株位于進(jìn)化樹的上部A區(qū)分支上，與法國、匈牙利分離株遺傳距離較近，15株位于進(jìn)化樹的下部B區(qū)分支上，

11、與英國分離株遺傳距離較近。
　　 3.JAK-STAT信號(hào)通路與PCV2感染的相互作用
　　 由于α-IFN激活JAK-STAT信號(hào)通路后，激活α-IFN效應(yīng)因子Mx1、OAS基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)GenBank中收錄的豬β-actin、Mx1、OAS基因序列，選擇其中的保守區(qū)，利用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，建立了針對(duì)對(duì)PK-15細(xì)胞的β-actin、Mx1、OAS基因的熒光定量PCR方法。參照該方

12、法進(jìn)行α-IFN的最佳作用時(shí)間和最佳作用濃度篩選。發(fā)現(xiàn)使用濃度為750 U/ml的α-IFN，處理PK-15細(xì)胞12小時(shí)后，α-IFN的效應(yīng)因子Mx1、OAS相對(duì)表達(dá)量最高，因此確定α-IFN處理的最佳作用時(shí)間為12h，最佳濃度為750U/ml。分別對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路特異性抑制劑AG490最佳作用濃度以及最佳作用時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用10μM的AG490作用于α-IFN處理的PK-15細(xì)胞6小時(shí)后，OAS的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最

13、低點(diǎn)接近空白對(duì)照細(xì)胞，而12小時(shí)左右Mx1的表達(dá)量才達(dá)到相對(duì)表達(dá)量最低，接近空白對(duì)照細(xì)胞，基本完全阻斷JAK-STAT信號(hào)通路，從而確定將AG490的最佳作用時(shí)間定為12小時(shí)，最佳作用濃度為10μM。以PK-15細(xì)胞作為空白對(duì)照，通過檢測分組檢測不同時(shí)間點(diǎn)OAS和Mx1基因的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PK-15細(xì)胞接種PCV2后，OAS和Mx1的相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照細(xì)胞低于α-IFN激活細(xì)胞JAK-STAT信號(hào)通路組。以PCV2單獨(dú)感染組作為

14、對(duì)照感染組，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的PCV2特異性熒光定量PCR方法，對(duì)PCV2的最佳收獲時(shí)間進(jìn)行確定并檢測不同分組PCV2的絕對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，病毒液中PCV2的含量逐漸增加，于接毒后72h病毒含量到達(dá)頂峰（3.109×108 copies），隨后病毒含量開始逐漸降低。應(yīng)用AG490抑制JAK-STAT信號(hào)通路后，PCV2的病毒絕對(duì)表達(dá)量量高于對(duì)照感染組，而通過α-IFN激活JAK-STAT信號(hào)通路組，PCV2病毒絕對(duì)