PCV2全基因組克隆及其衣殼蛋白的融合表達(dá).pdf

1、PCv2感染引起幾種明顯不同的病癥，包括PMWs、PDNS、繁殖障礙、豬呼吸病綜合癥、肉芽腫腸炎、壞死性淋巴腺炎、以及可能的滲出性表皮炎。給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。該研究做了以下三個(gè)實(shí)驗(yàn)，以獲得有效的疫苗，為最終控制該疫病打下基礎(chǔ)。 1. PCV2全基因的克隆與序列分析：用PCR擴(kuò)增PCV2全基因組，克隆到pMD18-T載體，成功構(gòu)建含PCV2全長(zhǎng)基因組的質(zhì)粒pMDTPCV2。測(cè)序后登錄GenBank，登錄號(hào)為AY94381

2、9。并將所測(cè)序列與國(guó)內(nèi)外毒株進(jìn)行了同源性比較及親緣關(guān)系分析。豐富了PCV2基因組序列資料，為以后建立分子生物學(xué)診斷方法及研究PMWS發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 2. △Cap與LTB高效融合表達(dá)：以pMDTPCV2為模板，擴(kuò)增Cap全基因，酶切回收后定向克隆到pET28a(+)相應(yīng)位點(diǎn)，成功構(gòu)建pETCap質(zhì)粒。在難以實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)的情況下，利用Cap基因本身具有的酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和下游引物HindⅢ酶切位點(diǎn)將Cap基因3’端396b

3、p序列切下(命名為△Cap)，回收后將其克隆至pETLTB質(zhì)粒相應(yīng)位點(diǎn)，成功構(gòu)建pETL,TB△Cap融合表達(dá)質(zhì)粒。用IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，融合蛋白分子量約為29kD，表達(dá)量約占36.67％。經(jīng)Western-Blot檢測(cè)，融合蛋白能被PCV2陽性血清識(shí)別。 3. 重組融合蛋白免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)：分離純化LTB△Cap重組融合蛋白，用常規(guī)的免疫程序免疫小白鼠。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。最后一次免疫后20天以PCV2感染小鼠組織勻漿進(jìn)行攻毒