PCV2 ORF2基因在大腸桿菌中的表達(dá)及與PCV2滅活抗原免疫效果的比較.pdf

1、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circovirus type2，PCV-2）是引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、皮炎和腎病綜合癥（PDNS）和豬呼吸道病復(fù)合征（PRDC）等多種疾病的主要病原之一。其流行廣泛及造成的巨大經(jīng)濟損失，已引起世界養(yǎng)豬業(yè)的重視。PCV-2 ORF2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白具有有型特異性抗原決定簇，因此它是區(qū)分PCV-1和PCV-2的重要抗原，它有望在血清學(xué)診斷中發(fā)揮作用。國內(nèi)外研究證明，Cap蛋白可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生

2、一定水平的抗體，對機體產(chǎn)生免疫保護作用，是構(gòu)建重組疫苗和檢測的首選基因。本研究通過PCV2 ORF2基因在大腸桿菌中獲得表達(dá)蛋白，采用不同劑量的表達(dá)蛋白和PCV2滅活抗原分別與弗氏不完全佐劑乳化配制疫苗，以豬作為動物模型，觀察其免疫效果。
　　 試驗一PCV2 ORF2基因在大腸桿菌中的表達(dá)
　　 根據(jù)已發(fā)表的PCV-2 ORF2基因序列，設(shè)計合成一對引物，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得一約531bp的特異性片段，與預(yù)

3、期結(jié)果相符。經(jīng)序列測定，其序列與目的基因序列一致。將PCR的擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切后連入pET-32a載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，證明成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-ORF2。篩選的陽性重組質(zhì)粒pET32a-ORF2和空表達(dá)載體pET32a，經(jīng)PCR和酶切鑒定，經(jīng)測序后，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用1 mmol/L的IPTG于37℃進行誘導(dǎo)表達(dá)，PCV-2 ORF2編碼的蛋白片段在大腸桿菌E.coli BL21中以包涵體的形式得到大量表達(dá)。分別取誘

4、導(dǎo)后1、2、3、4、5、6h后的誘導(dǎo)產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析。分析證明誘導(dǎo)表達(dá)6 h內(nèi)，蛋白表達(dá)量與隨誘導(dǎo)時間增加而增加，在5h蛋白表達(dá)量達(dá)到最大值。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)包涵體洗液純化后，Western blot可見有特異性條帶產(chǎn)生，獲得了理想的純化效果，表達(dá)的重組蛋白能被PCV-2的單克隆抗體所識別
　　 試驗二表達(dá)的cap蛋白與PCV2滅活抗原免疫效果的比較
　　 將稀釋至2.5mg/ml、1.25 mg/ml的表達(dá)蛋白和

5、稀釋至105TCID50/ml的PCV2滅活抗原分別與弗氏不完全佐劑乳化配制疫苗。將20頭30日齡左右的PCV2抗體及抗原陰性的的仔豬隨機分為4組，每組5頭，分別肌肉注射以上三種配制的疫苗及PBS各2ml、。首免后3周加強免疫，加強免疫后3周攻毒。攻毒后分別在第4、7天用鑰匙孔血藍(lán)蛋白（KLH）進行免疫刺激，并在攻毒后第4、7、11、19天用巰基乙酸培養(yǎng)基刺激，隔離飼養(yǎng)觀察，30天后全部宰殺。首免后定期采血測其ELISA抗體水平、中和抗

6、體水平，攻毒后通過臨床表現(xiàn)及體溫變化、相對日增重、病毒血癥、排毒情況及解剖時的病理變化等指標(biāo)評價疫苗效果。結(jié)果為：第一組刺激機體產(chǎn)生的ELISA抗體水平、中和抗體水平明顯高于其他免疫組和攻毒對照組（P<0.01）。攻毒后，第一組仔豬在相對日增重高于其他各組（P<0.01），攻毒期間體內(nèi)帶毒和體外排毒的仔豬數(shù)量最少（各2頭），帶毒與排毒的持續(xù)時間最短（分別在第11天和第7天消失）；病理切片顯微觀察顯示，攻毒后第一組的組織病理變化最為輕微。