PCV2感染性克隆構(gòu)建及ORF3蛋白功能研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小動(dòng)物病毒之一，分為兩型：PCV1和PCV2。PCV1無(wú)致病性，PCV2被認(rèn)為是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的病原，并且與其它多種豬病相關(guān)，而PMWS給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此PCV2成為研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)隨著PCV2的ORF3蛋白

2、具有細(xì)胞凋亡作用，與病毒致病性有關(guān)這一理論的提出與證實(shí)，關(guān)于ORF3蛋白功能的研究逐漸引起人們的重視。在已有理論基礎(chǔ)之上，本研究擬構(gòu)建PCV2感染性克隆，通過(guò)點(diǎn)突變?cè)觳《綩RF3蛋白，通過(guò)試驗(yàn)研究ORF3蛋白對(duì)病毒增殖的影響以及對(duì)細(xì)胞凋亡作用的影響，在病毒整體水平上研究ORF3蛋白功能，并確定主要作用區(qū)段。研究主要包括以下內(nèi)容：
　　 1、PCV2-SD株全基因組克隆測(cè)序與序列分析本研究從疑似感染PMWS的病豬體內(nèi)分離到一株P(guān)C

3、V2（命名為PCV2-SD），通過(guò)PCR得到病毒全基因組進(jìn)行序列分析表明，PCV2-SD的核苷酸序列與GeneBank登錄的一些具有代表性的PCV2參考序列同源性高達(dá)96％～98.9％，ORF3推導(dǎo)氨基酸同源性92％-99％。
　　 2、PCV2-SD株感染性克隆的構(gòu)建及改造將兩個(gè)病毒全基因組同向串聯(lián)入pUC19載體，構(gòu)建雙拷貝感染性克隆。在不影響ORF1正常氨基酸序列前提下，利用PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)對(duì)ORF3進(jìn)行改造，分別在OR

4、F3氨基酸的第1、27、51、79位終止表達(dá)，構(gòu)建四個(gè)ORF3缺失的感染性克隆。將這5個(gè)感染性克隆分別轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，IFA鑒定，結(jié)果表明這五個(gè)克隆均能拯救出具有感染性的病毒粒子。
　　 3、ORF3蛋白對(duì)PCV2-SD株生物學(xué)性能的影響研究將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒拯救出的五株病毒等量接種于PK-15細(xì)胞，分別在1h、12h、24h、36h、48h提取病毒DNA，定量PCR進(jìn)行核酸定量，結(jié)果說(shuō)明ORF3的完全或部分缺失對(duì)PCV2感染PK-