基于CMV啟動子構(gòu)建CVB3感染性克隆的初步研究.pdf

1、RNA病毒基因組較DNA病毒難以操作，對其進(jìn)行研究必須先通過反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建其感染性克隆。隨著各類研究方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段的不斷更新，反向遺傳學(xué)技術(shù)也在與時俱進(jìn)，各種新型的回復(fù)系統(tǒng)不斷建立。
　　 傳統(tǒng)的基于原核啟動子的回復(fù)系統(tǒng)的局限都是感染哺乳細(xì)胞時需要通過煩瑣的步驟來產(chǎn)生RNA聚合酶，增加了實(shí)驗(yàn)操作的難度，而且一些產(chǎn)生聚合酶的手段，如使用輔助病毒等，本身就會對實(shí)驗(yàn)有所干擾甚至由于輔助病毒對細(xì)胞的病變效應(yīng)（CPE）會影響負(fù)載細(xì)

2、胞的生存而導(dǎo)致病毒回復(fù)無法進(jìn)行。真核細(xì)胞都可以合成自身的RNA聚合酶，而且這些RNA聚合酶是真核細(xì)胞的內(nèi)源蛋白，不需要通過輔助手段（如上述的輔助病毒，輔助質(zhì)粒，構(gòu)建細(xì)胞系等）去產(chǎn)生就可以啟動真核啟動子的表達(dá)，十分方便，也從根本上杜絕了原核RNA聚合酶回復(fù)系統(tǒng)利用輔助病毒等對細(xì)胞CPE的發(fā)生；另外真核RNA聚合酶有的定位在細(xì)胞核，有的定位于細(xì)胞質(zhì)，為回復(fù)各種類型的病毒都提供了可能。目前，真核RNA聚合酶回復(fù)系統(tǒng)的優(yōu)越性已經(jīng)越來越明顯，成為

3、RNA病毒回復(fù)系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)。
　　 柯薩奇病毒（Coxsackie virus，CV）是一類常見的經(jīng)呼吸道和消化道感染人體的病毒，屬于微小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus genus）?？滤_奇病毒血清型分A，B兩組，A組有24個血清型，B組有6個血清型，能起一系列的臨床疾病。
　　 科薩奇病毒B組3型（CVB3）基因組為單股正鏈RNA，編碼一個大的開放讀碼框包括2207個氨

4、基酸，兩側(cè)為5’非編碼區(qū)（5’-NTR）和3’多聚腺苷非編碼區(qū)。5’-NTR包括一個Ⅰ型核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRE）使5’帽子能夠獨(dú)立翻譯成病毒多聚蛋白的起始。由于單股正鏈結(jié)構(gòu)，病毒基因組可以被核糖體立即翻譯來產(chǎn)生進(jìn)行病毒生活周期下一步所需要的多肽。
　　 CVB3的復(fù)制不經(jīng)過DNA的中間體，研究其結(jié)構(gòu)和功能比較困難，必須依賴反向遺傳學(xué)操作技術(shù)得到該病毒的感染性克隆。在感染性克隆的構(gòu)建過程中，設(shè)計(jì)一個有效的回復(fù)載體是至關(guān)重要的。鑒于

5、傳統(tǒng)回復(fù)載體的缺陷，本研究設(shè)計(jì)了一個RNA聚合酶Ⅱ驅(qū)動的病毒回復(fù)載體。利用CMV啟動子構(gòu)建CVB3感染性克隆載體：先將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的CMV啟動子下游區(qū)域通過PCR技術(shù)替換成設(shè)計(jì)好的多克隆位點(diǎn)區(qū)，分別插入PCR合成的HdvRz核心序列和polyA尾片段，形成框架載體pc-H-A，通過瞬時轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞初步鑒定pc-H-A的可用性；同時，為了得到CVB3病毒的全長序列，本研究用我室CVB3（nancy株）感染來Hela細(xì)胞，

6、取感染液上清提取病毒RNA，利用長鏈RT-PCR和長鏈PCR技術(shù)反復(fù)優(yōu)化條件擴(kuò)增病毒基因組全長片段；最后，將CVB3全長基因組序列克隆至設(shè)計(jì)好的框架載體pc-H-A中，篩選陽性克隆，并對篩選到的CVB3重組全長克隆其進(jìn)行測序鑒定和初步回復(fù)功能評價。
　　 綜上所述，本研究構(gòu)建了帶有CMV啟動子的回復(fù)框架載體pc-H-A并初步鑒定了該載體可用，利用此框架載體構(gòu)建了與基因庫中序列相似性為98％的CVB3全長cDNA克隆pc-CVB3