抑瘤基因NGX6啟動(dòng)子的克隆及初步功能研究.pdf

1、NGX6基因是中南大學(xué)腫瘤研究所分子遺傳室采用定位侯選克隆策略克隆的一個(gè)侯選抑瘤基因(基因登陸號(hào)：AF188239)，定位于染色體9p13.3區(qū)域。開(kāi)放閱讀框編碼的338個(gè)氨基酸，分子量為37kDa，具有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。胞外區(qū)含有一個(gè)EGF-like domain，3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。胞內(nèi)區(qū)較短，含有一個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。研究表明，NGX6基因在鼻咽癌和結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯下降。 前期研究發(fā)現(xiàn)NGX6基因能夠延緩細(xì)胞周期的進(jìn)程

2、；抑制腫瘤增殖和種植瘤的生長(zhǎng)；并能抑制腫瘤血管的生成；降低腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力，同時(shí)恢復(fù)腫瘤細(xì)胞間隙通訊；并通過(guò)抑制核內(nèi)β-catenin的表達(dá)負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin通路：負(fù)調(diào)控SPAK/JNK通路并抑制P-JNK核移位；下調(diào)EGFR-PKC-IRK-NF-κB通路的關(guān)鍵分子和轉(zhuǎn)錄因子；下調(diào)Ezrin下游與侵襲相關(guān)的通路中信號(hào)分子的表達(dá)。研究證實(shí)，NGX6蛋白的EGF樣結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)區(qū)是其調(diào)控細(xì)胞黏附的重要功能域，胞內(nèi)區(qū)是其調(diào)節(jié)

3、運(yùn)動(dòng)遷移的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。這些功能研究結(jié)果高度提示NGX6在可能腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。 本課題在前期工作的基礎(chǔ)上，研究了NGX6基因的上游分子事件即轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究，希望從調(diào)控該基因表達(dá)的上游基因的角度，明確該基因具體的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以進(jìn)一步揭示NGX6基因在腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制，深入闡明NGX6基因的生物學(xué)功能。 生物信息學(xué)分析NGX6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域首先應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)NG

4、X6基因5’側(cè)翼區(qū)序列進(jìn)行分析。在線軟件PromoterInspector的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示NGX6基因的調(diào)控區(qū)-157/+91的區(qū)間為其候選啟動(dòng)子區(qū)，而在線程序FirstEF分析結(jié)果表明-257/+407的區(qū)間為NGX6的候選啟動(dòng)子區(qū)。運(yùn)用軟件CpGplot和CpGFinder在線掃描NGX6基因的5'側(cè)翼區(qū)序列，分別發(fā)現(xiàn)其5'上游-107/+299或-21/+310的區(qū)間存在一個(gè)CpG島。這兩個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果大部分重疊，且與NGX6基因

5、候選啟動(dòng)子區(qū)域重疊。而TSSW和TRED預(yù)測(cè)NGX6基因的可能存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，這種情況在GC富集啟動(dòng)子區(qū)中是常見(jiàn)的，位于-50/+50區(qū)間。在線軟件MatInspector和TFSEARCH的分析結(jié)果顯示：NGX6基因啟動(dòng)子區(qū)為一個(gè)不含TATA盒，而含有CAAT盒的GC富集區(qū)。它含有多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中較重要的結(jié)合位點(diǎn)有：Sp1、Egr-1、RREB、P53、MYC-MAX和AP2等。 NGX6基因啟動(dòng)子的克隆及鑒定

6、以正常人外周血細(xì)胞基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)，獲得了NGX6基因調(diào)控區(qū)長(zhǎng)片段-357/+769，并通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)系統(tǒng)證實(shí)該區(qū)域具有與病毒SV40啟動(dòng)子同等強(qiáng)度的啟動(dòng)活性。接著以該長(zhǎng)片段為模板，依據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果，構(gòu)建了一系列的缺失突變體報(bào)告質(zhì)粒，定位了NGX6基因的近距離啟動(dòng)子為-159/+276區(qū)域。而同時(shí)采用綠色熒光蛋白活體檢測(cè)法進(jìn)一步驗(yàn)證了-159/+276區(qū)域的啟動(dòng)子活性。 轉(zhuǎn)錄因子Sp1對(duì)NGX

7、6基因表達(dá)的影響真核基因表達(dá)調(diào)控體系中最關(guān)鍵的是轉(zhuǎn)錄起始水平的調(diào)控，其基本機(jī)制主要包括順式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶三者之間的相互協(xié)同作用，其實(shí)質(zhì)是蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。在線軟件MatInspector和TFSEARCH分析NGX6基因的近距離啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域中以轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合位點(diǎn)最多，且Threshold值較高。轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)的特異性競(jìng)爭(zhēng)劑光輝酶素A(Mithramycin A)可大

8、幅度地抑制NGX6啟動(dòng)子活性，并明顯下調(diào)NGX6基因內(nèi)源性mRNA表達(dá)水平。 總之，我們成功獲得了NGX6的啟動(dòng)子區(qū)域，并確定了其近距離啟動(dòng)子區(qū)域。NGX6基因啟動(dòng)子區(qū)域是一個(gè)不含TATA盒，而含有CAAT盒的GC富集區(qū)，且該調(diào)控區(qū)內(nèi)存在一個(gè)CpG島。初步發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Sp1的抑制劑mithramycin A能夠明顯地抑制NGX6啟動(dòng)子地活性和NGX6基因的表達(dá)。對(duì)NGX6基因調(diào)控區(qū)的CpG島甲基化的探討以及其他的順式作用元件和反