F蛋白裂解位點修飾與外源基因重組病毒表達(dá)對重組LaSota病毒組織親嗜性和致病性的研究.pdf

1、重組新城疫病毒(NDV)作為活病毒載體疫苗具有很多的優(yōu)點，NDV弱毒疫苗安全、有效、遺傳穩(wěn)定、使用方便、生產(chǎn)成本低廉。重組NDV應(yīng)用廣泛，但是重組NDV存在著免疫機理不清楚，免疫效果不理想，使用方法不明確等問題。為了優(yōu)化重組NDV，本實驗就重組NDV的免疫機制、應(yīng)用等方面做了進(jìn)一步探索和研究。 1、反向遺傳操作重組新城疫病毒(rLaSota)對SPF雞氣管黏膜損傷研究及病毒組織嗜性研究本研究用課題組通過反向基因操作系統(tǒng)獲得的感染

2、性拯救病毒rLaSota按常規(guī)劑量106EID50(100μL/羽)，一次免疫2日齡、10日齡和20日齡SPF雛雞，分別在接種后的第1、3、5、10、15、18d剖檢取氣管，利用組織病理學(xué)和超微病理學(xué)檢測氣管黏膜的損傷程度，另外對免疫的2日齡雛雞取肝臟、肺臟、腎臟、大腦、脾臟，腺胃和十二指腸；利用免疫組化方法檢測重組疫苗株在雛雞體內(nèi)的組織嗜性。結(jié)果表明，用rLaSota接種的2日齡、10日齡和20日齡SPF雛雞，均沒有表現(xiàn)明顯臨床癥狀，

3、組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)氣管黏膜巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，黏膜固有層水腫，黏膜上皮細(xì)胞空泡化。掃描電鏡觀察氣管發(fā)現(xiàn)，杯狀細(xì)胞在接種后超常增生，纖毛細(xì)胞脫纖毛，黏液成分增多，在氣管黏膜表面有球形粒子，這也可能是機體免疫機制的表現(xiàn)。免疫組化結(jié)果表明rLaSota只在肝臟中的肝細(xì)胞中復(fù)制。 2、不同外源基因插入構(gòu)建的表達(dá)vvIBDV株VP2抗原和表達(dá)H5亞型重組重組NDV活載體疫苗對氣管黏膜的損傷及病毒組織嗜性的研究本研究用課題組通過

4、反向基因操作系統(tǒng)獲得的感染性拯救病毒重組疫苗株rLasota-HAmut(GD)和rLaSota-VP2分別按常規(guī)劑量106EID50(100μL/羽)一次免疫2日齡、10日齡和20日齡SPF雛雞，分別在接種后的第1、3、5、10、15、18d剖檢取氣管，利用組織病理學(xué)和超微病理學(xué)檢測氣管黏膜的損傷程度。另外對2日齡雛雞取肝臟、肺臟、腎臟、大腦、脾臟，腺胃、十二指腸利用免疫組化方法檢測重組病毒三雛雞體內(nèi)組織嗜性。 結(jié)果表明，在免

5、疫rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut(GD)時，不同日齡接種，雛雞均未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀；組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)氣管黏膜損傷程度與rLasota相似；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，外源基因的插入的重組疫苗株對氣管黏膜的損傷因外源基因的不同，損傷程度不同，HAmut(GD)對rLaSota疫苗株有較強的致弱型，rLaSota-HAmut(GD)對氣管黏膜的損傷程度減弱，電鏡觀察在氣管黏膜有大量的球形粒子。VP2基因?qū)LaSota疫苗株的

6、致弱性不強，用rLaSota-VP2接種的雛雞氣管黏膜損傷程度與rLaSota相似，電鏡觀察在氣管黏膜有球形粒子。免疫組化結(jié)果表明外源基因HAmut(GD)、VP2的插入對rLaSota病毒組織嗜性影響不大。rLaSota-HAmut(GD)接種后能在肝臟、肺臟檢測到病毒，rLaSota-VP2與rLaSota相同，接種后能在肝臟檢測到病毒。這說明rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut(GD)毒力不強，而且不同、日齡接種SP

7、F雞后，對雛雞造成的氣管黏膜損傷程度沒有太明顯的區(qū)別，因此rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut(GD)可用在較小日齡的初次免疫。 3、表達(dá)vvIBDV株VP2抗原重組NDV活載體疫苗、表達(dá)H5亞型重組活載體疫苗F蛋白裂解位點突變后構(gòu)建的重組病毒對SPF雞氣管粘膜損傷及組織嗜性的研究在前期實驗中，將rLasota-HAmut(GD)和rLaSota-VP2F蛋白裂解位點的氨基酸由分別設(shè)計突變引物將F蛋白裂解位點的氨基

8、酸112G-R-Q-G-R↓L117突變?yōu)?12R-R-Q-R-R↓F117，112R-R-Q-R-R↓L117命名為r1-F(M)-F，rl-F(M)-L，并拯救重組病毒。命名為r1-F(M)-F-HA，r1-F(M)-L-HA，r1-F(M)-F-VP2。分別按每只雞常規(guī)劑量106EID50(100μL/羽)免疫2日齡SPF雛雞，分別在接種后的第1、3、5、10、15、18d取氣管、肝臟、肺臟、腎臟、大腦、脾臟、腺胃、十二指腸，利用

9、組織病理學(xué)檢測氣管黏膜的損傷程度，利用免疫組化方法檢測重組病毒大雛雞體內(nèi)組織嗜性，研究F蛋白裂解位點突變對病毒組織嗜性的影響。 結(jié)果表明，重組毒株接種后，雛雞均未表現(xiàn)任何明顯臨床癥狀；組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)氣管黏膜損傷程度加大，幾乎無完整的結(jié)構(gòu):免疫組化結(jié)果表明rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut(GD)疫苗株F蛋白裂解位點突變后r1-F(M)-F-HA，r1-F(M)-L-HA，r1-F(M)-F-VP2對病毒的組織

10、嗜性的影響比較大，均能在肝臟、肺臟、腎臟、大腦、脾臟、腺胃、十二指腸檢測到病毒。這說明F蛋白裂解位點突變后氣管黏膜損傷嚴(yán)重，組織嗜性較廣，F(xiàn)蛋白裂解位點突變大大加大了rLaSota-VP2、rLaSota-HAmu(GD)的毒力和組織嗜性；r1-F(M)-F-HA，r1-F(M)-L-HA，r1-F(M)-F-VP2，適合較大日齡的雛雞接種，他們均可用于雛雞的加強免疫。 本研究是國內(nèi)、外首次用rLaSota為載體的重組病毒接種后