魚類諾達病毒對軍曹魚的致病性及其重組疫苗的研究.pdf

1、魚類諾達病毒(piscine nodavirus)是多種養(yǎng)殖魚類的重要病原，給養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失。 本文以赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒(RGNNV,Redspotted grouper-nervour necrosis virus)為研究對象，通過肌肉注射、浸泡和和共浴三種感染途徑研究了魚類諾達病毒對軍曹魚(Rachycentron canadum)仔魚(平均體重約3.6g)的致病性。結(jié)果表明，三種方法都能導(dǎo)致軍曹魚仔魚發(fā)病，病魚臨

2、床癥狀典型，如食欲減退、活動力下降、體色發(fā)黑、部分魚做螺旋狀或亢奮游動等。肌肉注射組、浸泡組和共浴組的累計死亡率分別為78％、44％和32％。采用逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)在患病魚的腦、眼、脊髓中均能檢測到諾達病毒，而在其它器官(鰓、腸、肝、脾、腎和肌肉)沒有檢測到，在肌肉注射組中檢出病毒的時間最早、檢出率最高；在共浴感染組和浸泡組檢測到病毒的時間較晚，檢出率較低。然而，在無臨床癥狀的幸存?zhèn)€體中也檢測到該病毒的存在。

3、 本文還根據(jù)RGNNV的RNA2的ORF核苷酸序列，設(shè)計了一對特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)擴增出了RGNNV的主衣殼蛋白(MCP)基因。擴增片段長為1017bp，編碼338個氨基酸，編碼蛋白的分子量約為37kD。將RGNNVD的MCP基因連接到表達載體pRSET A質(zhì)粒中，構(gòu)建了重組表達載體pRSET A-MCP，經(jīng)PCR、雙酶切和測序等方法驗證了目的基因連接的正確性。將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS進行融合表達，所

4、得融合蛋白分子量約為44.5kD。通過在不同培養(yǎng)基、不同溫度和不同pH的條件誘導(dǎo)表達，進一步優(yōu)化了表達條件，結(jié)果該重組菌在SOB和LB培養(yǎng)基，pH7.0，37℃條件下表達量較高，表達的融合蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在，提取的包涵中融合蛋白含量占60％以上，經(jīng)柱層析純化蛋白，純化度達90％以上。采取親和層析和SDS-PAGE割膠兩種方式對表達的融合蛋白進行純化，分別將兩種方式純化的融合蛋白做抗原來免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。

5、將重組BL21/pRSETA-MCP表達的融合蛋白制備成疫苗，腹腔注射免疫軍曹幼魚(重約8.6g)。免疫分為一次免疫組(A)、三次免疫組(B)和對照組(C)。在A組和B組中按照分別免疫10μ/尾、50μ/尾、100μg/的劑量依次分為A1、A2、A3組和B1、B2、B3組(每組25尾實驗魚)。A組的死亡率和發(fā)病率均比對照組C低。其中A2組的相對存活率和相對保護率分別為31％和28％，三次免疫組B的死亡率比和發(fā)病率也均比對照組C低。B2組

6、的相對存活率和相對保護率分別高達54％和56％。B2組和C組，累計死亡率呈現(xiàn)極顯著差異，P＜0.01，B2組和C組發(fā)病率呈現(xiàn)顯著差異，P＜0.04。兩個免疫組間比較，三次免疫組B的死亡率和發(fā)病率均比一次免疫組A低。而且對于免疫的劑量而言，也存在差異，免疫注射劑量并不是量越大越好，注射50μg/尾的B2組的免疫效果明顯好過10μg/尾的B1和100μg/尾的B3組?；疾∷劳鰝€體中檢測的陽性率各組均為100％，在幸存?zhèn)€體的檢測中B2組的陽性