早期干預(yù)糖基化終產(chǎn)物生成對(duì)糖尿病大鼠腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制作用的初步研究.pdf

1、本課題采用鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的1型糖尿?。═ype 1 diabetes mellitus，T1DM）大鼠模型作為觀察對(duì)象，利用氨基胍（Aminoguanidine，AG）干預(yù)AGEs生成，通過(guò)觀察早期抑制AGEs生成對(duì)糖尿病大鼠腎臟形態(tài)、功能的保護(hù)作用，及對(duì)腎臟ACE2，ACE及AngⅡ等iRAS關(guān)鍵成分的影響，探討早期抑制AGEs生成阻斷iRAS激活的可能機(jī)制，從而為DN的防治提供新的治療策略。具

2、體研究分為以下兩個(gè)部分： 第一章、早期干預(yù)AGEs生成對(duì)糖尿病大鼠腎臟形態(tài)及功能的保護(hù)作用。 目的： 通過(guò)觀察早期應(yīng)用氨基胍對(duì)STZ誘導(dǎo)的TIDM大鼠腎臟形態(tài)及功能的影響，探討早期抑制AGEs生成對(duì)糖尿病腎病發(fā)病的干預(yù)作用。 方法： 1、采用8周齡雄性Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分3組：（1）Ctrl組：正常對(duì)照組（n=7）；（2）DM組：糖尿病無(wú)干預(yù)組（n=14）；（3）DMA組：糖尿病氨基

3、胍干預(yù)組（n=14）。各組大鼠隔夜禁食12～16h后，予DM組和DMA組一次性腹腔注射STZ （55mg/Kg體重），Ctrl組注射等體積的0.1M檸檬酸緩沖液，72小時(shí)后尾靜脈采血，用快速血糖儀測(cè)定全血血糖，血糖≥16.7mmol/L為糖尿病造模成功。糖尿病制模成功后立即予DMA組氨基胍（AG，溶于飲水中，濃度為1g/L）每日飲用。為避免發(fā)生酮癥酸中毒和提高模型存活率，在造模4周內(nèi)對(duì)血糖超過(guò)30mmol/L的大鼠給予皮下注射長(zhǎng)效胰島素

4、（來(lái)得時(shí)）2～4U/隔日。 2、每4周檢測(cè)各組大鼠血糖，體重變化。給藥12周后，用代謝籠收集各組大鼠24h尿液，使用ELISA試劑盒檢測(cè)尿白蛋白含量。取血、尿標(biāo)本，檢測(cè)血肌酐濃度（Scr）以及尿肌酐濃度（Ucr），并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率（Ccr），結(jié)果用12周末的體重校正。以尿白蛋白排泄率（UAER）及Ccr作為評(píng)價(jià)腎功能的指標(biāo)。 3、腎組織的處理及病理改變?cè)u(píng)價(jià)指標(biāo)：STZ注射后第12周末，大鼠麻醉后，在腹主動(dòng)脈末端插入導(dǎo)

5、管，取血注入促凝管中待測(cè)血肌酐，后用PBS以適當(dāng)速度進(jìn)行原位腎臟灌洗以清除腎內(nèi)血液，取下雙腎，迅速剝?nèi)ツI包膜，稱(chēng)重后縱向剖開(kāi)腎臟，切取0.5×0.5×0.2cm大小腎臟組織置于10%中性福爾馬林緩沖液中固定20h。常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，切片厚度2um，過(guò)碘酸席夫氏染色（PAS）染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。腎臟病理評(píng)價(jià)指標(biāo)如下：（1）腎臟質(zhì)量指數(shù)（RMI）：RMI=雙腎平均重量/體重；（2）腎小球肥大：運(yùn)用Image-Pro P

6、lus 5.1彩色圖像分析系統(tǒng)，測(cè)量腎小球橫截面面積（Ag），腎小球體積（Vg）=1.25×（Ag）3/2。（3）系膜基質(zhì)擴(kuò)張程度：半定量評(píng)分（1～4分）1分-正?；蜃钚?；2分-輕度；3分-中度； 4分-彌漫性。（4）腎小管病變程度：半定量評(píng)分（1～4分）1分：病變1～25%；2分：病變26～50%；3分：病變51～75%；4分：病變>75。 4、統(tǒng)計(jì)方法：所有數(shù)據(jù)由SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±

7、s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性時(shí)用單因素方差分析（ONE-WAYANOVA），進(jìn)一步組間多重比較采用Bonferroni法。不滿(mǎn)足方差齊性用Welch法對(duì)F值進(jìn)行校正，進(jìn)一步多重比較用Dunnett T3法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不符合正態(tài)分布時(shí)用Kruskal-Wallis H法，兩組間比較用Mann-Whitney U法，P<校正后的α為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、各組大鼠在造模前體重?zé)o顯著差異（P=

8、0.968）。STZ造成糖尿病模型成功后，糖尿病大鼠血糖顯著高于Ctrl組大鼠血糖（P<0.01），氨基胍進(jìn)行干預(yù)前，DM組與DMA組大鼠血糖無(wú)顯著差異（P=0.684）。DM組大鼠血糖隨著時(shí)間呈進(jìn)行性升高，并且體重明顯低于正常組（P<0.01）， 50%的DM大鼠于10周左右出現(xiàn)單或雙眼白內(nèi)障。DMA組大鼠4、8周末血糖水平與DM組無(wú)明顯差異（P>0.05），第12周末血糖較DM組減少（P<0.05），與DM組大鼠相比，DMA組大鼠體

9、重改善不明顯（P>0.05），23%的DMA大鼠于10周左右出現(xiàn)單或雙眼白內(nèi)障。 2、腎臟功能：DM組大鼠24小時(shí)UAER及Ccr均顯著高于Ctrl組（P<0.01），DMA組大鼠UAER顯著低于DM組大鼠（P<0.001），Ccr雖然較DM組有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 3、腎臟病理改變：光鏡下，12周末DM組大鼠腎組織可見(jiàn)腎小球的毛細(xì)血管球肥大，系膜基質(zhì)輕度增生，腎小管上皮細(xì)胞肥大。與Ctrl組大鼠相比

10、，DM組大鼠腎臟質(zhì)量指數(shù)，腎小球橫截面面積和體積，腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張，腎小管病變程度均顯著增加（P<0.05），DMA組大鼠腎臟質(zhì)量指數(shù)，腎小球橫截面面積，腎小球體積，及腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張，腎小管病變程度均較DM組顯著減少（P<0.05）。 結(jié)論： 1、STZ誘導(dǎo)的TIDM大鼠在第12周末已發(fā)展為早期腎病，表現(xiàn)為腎小球肥大，系膜基質(zhì)增生和腎小管病變等，并出現(xiàn)明顯的白蛋白尿，肌酐清除率增加； 2、早期抑制AGEs能

11、夠保護(hù)腎臟正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，并且顯著降低尿白蛋白，延緩了DN進(jìn)展。 第二章、早期干預(yù)AGEs生成對(duì)糖尿病大鼠iRAS抑制作用的初步研究。 目的： 通過(guò)氨基胍早期干預(yù)，觀察早期抑制AGEs生成對(duì)T1DM大鼠腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（iRAS）關(guān)鍵成分的影響，探討干預(yù)AGEs生成對(duì)iRAS抑制作用的可能機(jī)制。 方法： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組和干預(yù)措施同第一部分。 2、取第一部分中已處理的各組大鼠的腎臟

12、組織蠟塊，以石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚度5um。用免疫組化法標(biāo)記ACE2，ACE及Ang Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞，觀察ACE2，ACE及Ang Ⅱ在各組大鼠腎臟中的分布，運(yùn)用Image-Pro Plus 5.1彩色圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)的平均光密度值表示上述指標(biāo)表達(dá)情況。 3、腎組織總RNA的提取用Trizol提取法，半定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)腎組織ACE2mRNA表達(dá)情況，凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，檢測(cè)各組ACE2mRNA條帶的灰度值，并計(jì)算ACE2m

13、RNA條帶與內(nèi)參β-actin條帶的灰度比值，觀察ACE2mRNA表達(dá)情況。 4、統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)由SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s表示，符合正態(tài)分布和方差齊性時(shí)用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），進(jìn)一步組間多重比較采用Bonferroni法。不滿(mǎn)足方差齊性用Welch法對(duì)F值進(jìn)行校正，進(jìn)一步多重比較用Dunnett T3法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1

14、、氨基胍對(duì)糖尿病大鼠AGEs表達(dá)的影響：12周末，正常大鼠腎小管及腎小球見(jiàn)少量AGEs表達(dá)。DM組大鼠腎小管中AGEs表達(dá)明顯增多，腎小球及間質(zhì)中也見(jiàn)表達(dá)。DMA組大鼠腎小管及腎小球中AGEs表達(dá)減少。 2、氨基胍對(duì)糖尿病大鼠ACE2表達(dá)的影響：與正常大鼠相比，DM組大鼠腎小管及腎小球中ACE2免疫組化陽(yáng)性染色顯著降低（P均<0.01）。DMA組較DM組大鼠腎小管及腎小球中ACE2陽(yáng)性染色顯著增加（P均<0.01）。 3

15、、氨基胍對(duì)糖尿病大鼠ACE表達(dá)的影響：與正常大鼠相比，DM組大鼠腎小球、腎小管、腎小動(dòng)脈內(nèi)皮ACE免疫組化陽(yáng)性染色均顯著增加（P均<0.01）。DMA組腎小球、腎小管、腎小動(dòng)脈內(nèi)皮ACE陽(yáng)性染色顯著減少（P均<0.01）。 4、氨基胍對(duì)糖尿病大鼠AngⅡ表達(dá)的影響：與正常大鼠相比，DM組大鼠腎小管及腎小球中AngⅡ免疫組化陽(yáng)性染色顯著增加（P均<0.01）。DMA組較DM組大鼠腎小管及腎小球中AngⅡ陽(yáng)性染色顯著降低（P均<0.

16、01）。 5、氨基胍對(duì)糖尿病大鼠ACE2mRNA表達(dá)的影響：與正常大鼠相比，DM組大鼠腎臟ACE2mRNA表達(dá)顯著減少（P<0.01）。DMA組較DM組大鼠腎臟ACE2mRNA表達(dá)顯著增加（P<0.01）。 結(jié)論： 1、第12周末糖尿病大鼠AGEs在腎內(nèi)大量蓄積，同時(shí)iRAS激活，主要表現(xiàn)為腎內(nèi)ACE2表達(dá)減少，ACE、AngⅡ表達(dá)明顯增多，加速DN進(jìn)展； 2、早期干預(yù)AGEs生成能顯著延緩DN發(fā)生，機(jī)制