PLOD2反義基因治療組織纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、立題依據(jù)及意義：　　瘢痕形成是燒傷后常見的并發(fā)癥，其臨床治療方法較多，但效果均不盡人意。隨著近年瘢痕形成的分子機(jī)制進(jìn)一步明了，很多學(xué)者逐步嘗試從基因水平開展纖維化治療研究。 纖維化的主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matfix,ECM)的過度沉積，ECM主要包括膠原、非膠原糖蛋白以及蛋白聚糖。當(dāng)纖維化發(fā)生時，ECM的量和質(zhì)均發(fā)生顯著變化，其中膠原量可較正常增加3—8倍，并且主要以I型膠原增加為主?！　⊙芯堪l(fā)

2、現(xiàn)，膠原的形成及穩(wěn)定與賴氨酸羥化酶(1ysyl hydroxylase簡寫LH)有密切的關(guān)系<'[1-4]>。LH包括LH1、LH2、LH3，它們分別被PLOD1(procollage-lysine 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1)、PLOD2、PlLOD3基因編碼<'[5-7]>，其中LH2在纖維化過程中，表達(dá)量大大增加<'[8]>，與纖維化的形成關(guān)系密切?！　≠嚢彼崃u化酶廣泛存在于人體組織中<'[9,

3、10]>，它的主要生理功能是把膠原蛋白分子中的賴氨酸羥化成羥賴氨酸，促使膠原蛋白分子之間共價交鏈的形成和穩(wěn)固。 　 Van derSlot等<'[13]>發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生纖維化損害時，LH2的產(chǎn)生明顯增加；Uzawa等<'[14]>研究證實(shí)，瘢痕瘤患者皮膚比正常人皮膚中的端肽賴氨酸羥化增加約25％。由于賴氨酸羥化酶大大增力口了吡啶交鏈尤其是HP的生成，因此膠原分子就變得難以降解而發(fā)生積聚<'[15]>?！　∧壳?/p>

4、對LH2的結(jié)構(gòu)及功能有所認(rèn)識<'[16-18]>，隨著對LH以及其參與的病理過程研究的深入，LH有可能成為某些疾病尤其是纖維化治療的靶點(diǎn)，所以發(fā)現(xiàn)、設(shè)計(jì)及合成 一些LH的抑制劑是一項(xiàng)重要研究?！　⊙芯堪l(fā)現(xiàn)，LH的類似物通過對LH的競爭性抑制能有效地抑制膠原蛋白的翻譯后修飾過程<'[19]>，如敏樂定(minxidil)，它不但能抑制LH的活性，而且能有效地抑制人類成纖維細(xì)胞的增殖；有機(jī)磷酸脂類是另一類LH的抑制劑，它可直接抑制LH，

5、減少胚肺成纖維細(xì)胞中膠原賴氨酸的羥化。但這類抑制劑要么毒性太大、要么無效而限制了在臨床上的應(yīng)用，迄今為止，還沒有開發(fā)出有效的治療纖維化疾病的新藥。 自Stephenson首次應(yīng)用反義ODN特異性抑制Rous肉瘤病毒的復(fù)制并提出了反義ODN抑制基因表達(dá)的概念以來，反義ODN技術(shù)經(jīng)過十多年發(fā)展已經(jīng)成為一種可以選擇性和特異性地阻斷目的基因表達(dá)的技術(shù)，是基因治療的重要組成部分。反義ODN與其他藥物及治療措施相比，最大優(yōu)點(diǎn)在于其直接調(diào)控基

6、因的表達(dá)很少受細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的代謝過程的影響?！　”狙芯渴紫冗x取瘢痕和正常皮膚組織標(biāo)本，采用RT-PCR和Western blot方法，分別檢測組織PLD2mRNA表達(dá)及Ⅰ型膠原蛋白含量，探討PLOD2表達(dá)與Ⅰ型膠原形成之間的關(guān)系，為應(yīng)用PLOD2反義ODN治療纖維化提供實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)；然后設(shè)計(jì)并合成三條PLOD2反義ODN(分別針對于PLOD2翻譯起始部位、第一和第二外顯子連接部、翻譯終止部三種序列)，將成纖維細(xì)胞分別給予上述反義ODN

7、處理后，檢測細(xì)胞PLOD2mRNA表達(dá)及Ⅰ型膠原蛋白含量的變化，據(jù)此來評判反義ODN抑制Ⅰ型膠原形成的效果，并篩選出最佳抑制效果的反義基因序列，從而為PLDD2反義ODN治療纖維化提供一個翔實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)；另外通過檢測瘢痕組織與正常皮膚組織COLIα1 mRNA表達(dá)，以及反義ODN處骺的成纖維細(xì)胞COLIαl mRNA表達(dá)的差異，探討PLOD2調(diào)控Ⅰ型膠原形成的可能機(jī)制。 第一部分：瘢痕組織PLOD2表達(dá)與膠原形成的研究

8、 目的： 采用RT-PCR和Western b1Ot方法，檢測瘢痕組織與正常皮膚組織中PL0D2 mRNA表達(dá)及I型膠原蛋白含量的差異，從分子生物學(xué)水平來探討PL0D2表達(dá)與膠原形成的關(guān)系，為開展PLOD2反義ODN治療纖維化研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 實(shí)驗(yàn)分為兩組：瘢痕組織組和正常皮膚組織組。每組手術(shù)標(biāo)本各6例。分別提取各組織標(biāo)本總RNA和總蛋白。設(shè)計(jì)并合成PLOD2及COLIαl引物，應(yīng)用RT-

9、PCR方法檢測PLOD2 mRNA及COLTαlmRNA的表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參照，比較兩組之間PLOD2 mRNA和COLIαlmRNA表達(dá)量的差異；應(yīng)用Westem bl0t方法檢測組織I型膠原蛋白的含量，比較兩組之間的差異。 結(jié)果： 1.組織PL,OD2mRNA表達(dá)：瘢痕組織PLO2／β-actin比值是5.41±0.32，正常皮膚組織的比值為1.61±0.31，結(jié)果顯示瘢痕組織PL0D2 mR

10、NA的表達(dá)量高于正常組織組，有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。 2.組織COL,IalmRNA的表達(dá)：瘢痕組織COLIαl／β-actin比值是4.08±0.15，正常皮膚組織的比值為3.93±0.21，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 3.組織I型膠原蛋白含量：瘢痕組織I型膠原相對值為46.43±1.06，正常皮膚組織為10.09±0.33，結(jié)果顯示瘢痕組織I型膠原含量明顯高于正常皮膚組織，有非

11、常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。 討論與結(jié)論： 瘢痕是燒傷創(chuàng)面愈合過程中常見并發(fā)癥，當(dāng)組織受到損傷后，靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞被激活，成纖維細(xì)胞分裂增生并分泌前膠原蛋白，由于病變部位成纖維細(xì)胞合成膠原不成比例的增加，膠原過量沉積，大量平行或交錯分布的膠原纖維束形成瘢痕。 　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：瘢痕組織中的PLOD2 mRNA的表達(dá)量明顯高于正常皮膚組織，而且瘢痕組織中Ⅰ型膠原蛋白的含量是正常皮膚組織的四倍多，提示P

12、LOD2高表達(dá)與Ⅰ型膠原形成存在相關(guān)性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為第二部分實(shí)驗(yàn)《PLOD2反義ODN治療纖維化》奠定了基礎(chǔ)。我們設(shè)想：應(yīng)用反義ODN來封閉成纖維細(xì)胞內(nèi)PLOD2表達(dá)，達(dá)到降低Ⅰ型膠原形成的目的，從而為基因治療纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.細(xì)胞C0t,IalmRNA的表達(dá)：翻譯起始部、第-外顯子和第二外顯子連接部、翻譯終止部的反義0DN C0L,Ial／p-actin比值分別是l.08±0.05、1.08±0.04、1.10±0.0

13、2，錯義0DN組及空白組分別為1.13±0.01、1-14±0.04，各反義組與對照組相比細(xì)胞C0L,IalmRNA的表達(dá)未見下降，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 3.I型膠原蛋白含量：翻譯起始部、第_外顯子和第二外顯子連接部、終止密碼部的反義IDDN組I型膠原蛋白的相對值分別是5.24±0.16、7.68±0.32、7.22±0.25，錯義0DN組和空白組I型膠原蛋白的相對值是9.07±0.18、9.37±0.11。實(shí)驗(yàn)

14、結(jié)果顯示：反義0DN組均能抑制I型膠原蛋白的形成，與錯義組及對照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。其中翻譯起始部反義ODN組的抑制效率最高，抑制率為44％。 討論與結(jié)論： 燒傷愈合后常常遺留瘢痕，手術(shù)治療是較常用的方法，但增加了患者的痛苦，由于近幾十年分子生物學(xué)迅猛發(fā)展以及瘢痕機(jī)制的進(jìn)一步明確，許多學(xué)者正試圖采用基因治療的方法來治療瘢痕纖維化。 根據(jù)第—部分實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，我們設(shè)計(jì)并合成PLOD2反義ODN作

15、用于成纖維．細(xì)胞，觀察該反義基因抑制I型膠原形成的效果。 反義ODN是針對某一段特異的mRNA或DNA合成與其互補(bǔ)的一條寡核苷酸鏈，由于其互補(bǔ)特性，它能特異性發(fā)揮阻斷靶基因的表達(dá)功能。反義ODN與其他藥物及治療措施相比，其最大優(yōu)點(diǎn)在于直接調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，很少受細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的代謝影響。 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成了三條反義ODN(分別針對PLOD2翻譯起始部位、第一和第二外顯子連接部、翻譯終止部)開展基因治療的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：三

16、條反義ODN都能夠特異性抑制PLOD2 mRNA的表達(dá)，但是由于它們作用的靶點(diǎn)不同，因而抑制效果也不同，其中作用于翻譯起始部位的反義ODN抑制效率最高，抑制率為57％左右，終止密碼部的反義ODN次之，第一外顯子和第二外顯子連接部反義ODN效果最差，該結(jié)果為應(yīng)用PLOD2反義ODN治療纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并篩選出最佳的反義基因序列。 針對不同靶基因序列的反義ODN，其封閉效果不一，究其原因很多。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示翻譯起始部位的反義0

17、DN抑制效率最高，我們認(rèn)為可能是反義ODN與翻譯起始部位的親和力高于翻譯終止部位及第一和第二外顯子連接部，所以產(chǎn)生了最好的阻斷靶基因表達(dá)效果。 通過檢測Ⅰ型膠原蛋白含量發(fā)現(xiàn)：三條反義ODN均能抑制成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白形成，其中作用于翻譯起始部位的反義ODN抑制效率最高，終止密碼部的反義ODN次之，第一外顯子和第二外顯子連接部反義ODN效果最差，進(jìn)一步從蛋白水平驗(yàn)證了反義ODN阻抑纖維化形成的效果。 本研究結(jié)果提示反義O