草莓乙烯受體反義基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、草莓(Fragaria ananassa Duch)是一種重要的小型漿果，在世界范圍內(nèi)廣泛栽種，近年來育出很多優(yōu)良品種，種植面積逐漸擴(kuò)大。然而仍有很多因素限制了草莓生產(chǎn)的發(fā)展，其中一個(gè)重要難題就是草莓果實(shí)難以保鮮、不耐貯運(yùn)?；蚬こ碳夹g(shù)為植物育種、種質(zhì)資源開發(fā)利用等領(lǐng)域開辟了新的途徑，可以獲得常規(guī)育種難以或無法得到的新類型。 果實(shí)成熟是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，而乙烯是引發(fā)果實(shí)成熟的主要因素之一。乙烯能從其生物合成和感知與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

2、兩方面進(jìn)行調(diào)控，相對(duì)于人們對(duì)乙烯生物合成途徑的了解而言，有關(guān)植物感知乙烯及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的知識(shí)了解甚少，目前對(duì)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究主要集中在擬南芥上。草莓是非躍變型果實(shí)，也能產(chǎn)生乙烯，某些情況下乙烯可能參與草莓的成熟，乙烯和草莓成熟之間的關(guān)系，不同的試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)彼此矛盾，目前并沒有明確的結(jié)論，至今沒有結(jié)果明確表明乙烯和非躍變型果實(shí)成熟的關(guān)系。乙烯感知和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的初始成分是乙烯受體，乙烯的生理作用最終是通過乙烯受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程完成的。

3、目前草莓上分離出3個(gè)乙烯受體基因，本試驗(yàn)采用反義RNA技術(shù)試圖了解乙烯在草莓果實(shí)成熟衰老中的作用及這些乙烯受體的功能和作用方式。 本試驗(yàn)對(duì)草莓組織培養(yǎng)體系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓遺傳轉(zhuǎn)化體系。構(gòu)建了草莓反義乙烯受體表達(dá)載體pBI121Etr1、pBII21Ers1和pBII21Etr2及同時(shí)含有草莓乙烯受體FaEtr1和FaErs1的雙價(jià)植物表達(dá)載體pFRS，用于轉(zhuǎn)化草莓，成功的獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行了相關(guān)分子生

4、物學(xué)鑒定，獲得反義轉(zhuǎn)基因材料對(duì)探討乙烯受體作用以及乙烯在草莓等非躍變型果實(shí)成熟的調(diào)控機(jī)理具有重要意義，也為后續(xù)研究提供了寶貴的試驗(yàn)材料。 1.在已報(bào)道的FaEtr1、FaErs1和FaEtr2基因序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異引物，分別克隆草莓乙烯受體FaEtr1基因580 bp部分特異序列、FaErs1基因445 bp部分特異序列和FaEtr2基因345 bp部分特異序列，將上述3個(gè)片段分別反向插入植物表達(dá)載體pBII21的CaMV3

5、5s啟動(dòng)子和Nos終止子之間，構(gòu)建了反義表達(dá)載體pBI121Etr1、pBII21Ers1和pBII21Etr2。將帶有完整啟動(dòng)子和終止子的FaEtr1和FaErs1基因引入pCAMBIA2301中，最終獲得FaEtr1和FaErs1的雙價(jià)植物表達(dá)載體pFRS。通過PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定重組質(zhì)粒pBI121Etr1、pBI121Ers1、pBI121Etr2和pFRS。將這4個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，PCR及限制

6、性內(nèi)切酶酶切確定質(zhì)粒已被導(dǎo)入。 2.以‘豐香’、‘鬼露甘’、‘全明星’、‘嫜姬’、‘哈利’、‘幸香’6個(gè)草莓品種為試材，研究了影響草莓不定芽再生的各種因素，建立離體葉片高效再生系統(tǒng)。結(jié)果表明，外植體基因型、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及配比、葉齡等是影響草莓再生的主要因子。其中‘鬼露甘’葉片最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg.L-1+IBA 0.1 mg.L-1，‘嫜姬’葉片愈傷組織的誘導(dǎo)以MS+6-BA 3 mg.L-1+2

7、,4-D 0.2 mg.L-1較好；芽伸長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5 mg.L-1+IBA 0.5 mg.L-1；生根的最適培養(yǎng)基為MS+IBA 0.2 mg.L-1，試管苗移栽后成活率為87％。另外，1W左右的暗培養(yǎng)可以防止外植體的褐化。 3.利用帶有內(nèi)含子的gus基因的瞬時(shí)表達(dá)，研究影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)‘鬼露甘’草莓遺傳轉(zhuǎn)化的若干因素。結(jié)果表明：草莓葉片外植體對(duì)卡那霉素較為敏感，適宜的篩選濃度為20 mg.L-1，可明

8、顯抑制非轉(zhuǎn)化組織的生長(zhǎng)；300 mg.L-1的羧吩青霉素可有效抑菌，對(duì)外植體生長(zhǎng)影響也較?。活A(yù)培養(yǎng)2～4d有利于轉(zhuǎn)化：共培養(yǎng)2～3d有利于提高轉(zhuǎn)化頻率并避免了農(nóng)桿菌的過度生長(zhǎng)；OD600nm值為0.4的菌液侵染10min效果最佳。再生植株經(jīng)PCR檢測(cè)初步證明gus基因已成功整合到草莓基因組中。 4.通過根癌農(nóng)桿菌EHA105將含有反義FaEtr1和.FaErs1基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體pFRS導(dǎo)入草莓，經(jīng)卡那霉素選擇壓下連續(xù)分化選

9、擇、擴(kuò)繁和生根培養(yǎng)并經(jīng)PCR和Southern blot檢測(cè)證明，其中15株的基因組已成功導(dǎo)入和整合反義FaEtr1和FaErs1基因。Northern分析表明，轉(zhuǎn)入的反義基因?qū)Π谢蚨加胁糠值囊种啤?通過根癌農(nóng)桿菌EHA105將含有反義FaEtr2基因的植物表達(dá)載體pBI121Etr2導(dǎo)入草莓，經(jīng)卡那霉素選擇壓下連續(xù)分化選擇、擴(kuò)繁和生根培養(yǎng)，并經(jīng)PCR和Southern blot檢測(cè)證明，其中26株的基因組已成功導(dǎo)入和整合反義