石斛蘭ACS反義基因的遺傳轉(zhuǎn)化及離體開花的研究.pdf

1、石斛蘭(Dendrobiun spp.)為蘭科石斛蘭屬植物，是一種熱帶氣生蘭，因其花姿優(yōu)美、色彩艷麗，成為各國花卉市場上最受歡迎的“四大洋蘭”之一。本文研究以石斛蘭的莖段和試管苗葉片為材料誘導(dǎo)原球莖，建立石斛蘭高效再生體系和受體系統(tǒng)；采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對石斛蘭原球莖進行ACS反義基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究。此外，還對石斛蘭的試管開花進行了初步探討。主要研究結(jié)果如下： 1石斛蘭高效再生體系的建立。以石斛蘭的莖段和試管苗葉片、石斛蘭蒴果(

2、包含4個品種：玫瑰紅大花、淡紅淡條、紫紅、白花)為材料，研究了石斛蘭再生系統(tǒng)建立的有效途徑。結(jié)果表明：石斛蘭莖段在KC+0.2 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA培養(yǎng)基中原球莖誘導(dǎo)率為35.57％，KC+4.0 mg/L 6.BA+1.0 mg/L NAA是葉片誘導(dǎo)原球莖的最佳培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為11.99％；原球莖適宜增殖的培養(yǎng)基為KC+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，增殖倍數(shù)達到8.02，而分化培養(yǎng)基為1

3、/2MS+0.5 mg/L 6-BA；最佳的壯苗生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L NAA。 2石斛蘭受體系統(tǒng)的建立及其優(yōu)化。以石斛蘭的莖段和試管苗葉片為材料誘導(dǎo)原球莖，通過不同激素濃度、糖類型和糖濃度建立了淡綠色細小原球莖受體系統(tǒng)。針對pH、瓊脂濃度、天然附加物、基本培養(yǎng)基、光照強度、培養(yǎng)方式等影響因素，優(yōu)化石斛蘭原球莖受體系統(tǒng)生長條件。結(jié)果表明：附加2.0 mg/L6-BA和0.5 mg/LNAA的KC培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出淡

4、綠色細小且致密的原球莖，適宜作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。原球莖受體系統(tǒng)的最佳培養(yǎng)條件為20.0 g/L白糖為最佳糖源和糖濃度、無任何附加物、pH為5.4、瓊脂濃度為5.8 g/L的KC培養(yǎng)基中，采用固體培養(yǎng)方式將原球莖培養(yǎng)于1500 lx光照強度下。石斛蘭原球莖對卡那霉素敏感，150.0 mg/L卡那霉素能夠有效地抑制原球莖的生長并使其致死，而50.0 mg/L卡那霉素能夠有效地抑制未轉(zhuǎn)化植株的生根，因此，150.0 mg/L卡那霉素和50

5、.0 mg/L卡那霉素分別為石斛蘭進行遺傳轉(zhuǎn)化時原球莖受體系統(tǒng)和小苗生根培養(yǎng)的有效選擇壓濃度。 3根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)ACS反義基因?qū)胧m轉(zhuǎn)化體系的確立。試驗結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化試驗條件為不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的石斛蘭原球莖，侵染前經(jīng)過切割后培養(yǎng)于附加0.3 mol/L甘露醇的高滲固體培養(yǎng)基進行前處理6 h，農(nóng)桿菌重懸液濃度OD600為0.8左右，農(nóng)桿菌重懸液白糖濃度為20.0 g/L，接菌時間為30 min，在25℃黑暗條件下于附加2.0 m

6、g/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的KC培養(yǎng)基中共培養(yǎng)5 d，共培養(yǎng)培養(yǎng)基pn值為5.4。以此條件進行了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化試驗。 4石斛蘭抗性原球莖和再生植株的篩選和檢測。對轉(zhuǎn)化ACS反義基因的轉(zhuǎn)化體進行抗性篩選及轉(zhuǎn)基因植株再生研究，對再生植株葉片進行GuS穩(wěn)定表達檢測和gus基因的PCR：檢測。采用延遲篩選法先對侵染過的原球莖在KC+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+100.0 mg/L Cef.培養(yǎng)基上進行

7、恢復(fù)生長20 d，再采用逐步提高卡那霉素濃度后，置于KC+2.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+150.0 mg/L Km培養(yǎng)基下篩選3個月，選擇后的原球莖置于1/2MS+0.5 mg/L 6-BA分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，將分化的小苗轉(zhuǎn)移到1/2MS+1.0 mg/L NAA+50.0 mg/LKm.+100.0 mg/L Cef.篩選壯苗生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。共獲得了13株具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化效率達到1

8、2.15％。轉(zhuǎn)化植株經(jīng)GUS組織化學(xué)檢測和gus基因的PCR檢測證實gus基因已整合進石斛蘭基因組中。轉(zhuǎn)基因植株在形態(tài)上與未轉(zhuǎn)基因植株無差別，轉(zhuǎn)基因植株移栽2個月后都已成活。 5石斛蘭試管苗離體開花的初步研究。以苗齡為2個月左右的石斛蘭無根試管苗為材料，研究了適宜于誘導(dǎo)石斛蘭開花的培養(yǎng)基。針對基本培養(yǎng)基、6-BA、糖3個因素進行正交設(shè)計試驗，研究其對開花的影響。結(jié)果表明：經(jīng)過150 d的培養(yǎng)后，KC2+5.0 mg/L6-BA+

9、40.0 g/L白糖培養(yǎng)基中，25.0％的無根小苗能夠誘導(dǎo)開花，其花蕾正常，但不能夠正常開放?；九囵B(yǎng)基、6-BA、糖等3個因素對石斛蘭無根小苗開花的影響依次為6-BA>基本培養(yǎng)基>糖濃度。 總之，本研究建立了石斛蘭高效再生體系；獲得了淡綠色細小且致密的原球莖受體系統(tǒng)；首次將ACS反義基因轉(zhuǎn)入石斛蘭并建立了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系；摸索出了石斛蘭抗性原球莖的篩選方法和篩選時期；首次發(fā)現(xiàn)在不使用AS時，高濃度糖處理可以提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化石斛