農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)β-甘露糖苷酶正義、反義基因的棉花.pdf

1、棉纖維是紡織工業(yè)的重要原料，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。因此，從分子水平闡明棉纖維發(fā)育的機(jī)理，具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。 為了研究β-甘露糖苷酶(GhManA2)在棉纖維發(fā)育中的確切功能，．本研究將其基因序列以正向，反向構(gòu)建到由纖維特異啟動(dòng)子E6驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體pBll21中，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入棉花，試圖通過(guò)該基因在纖維發(fā)育中的過(guò)量表達(dá)和抑制表達(dá)對(duì)棉纖維發(fā)育的影響來(lái)研究其在纖維發(fā)育中的確切功能。本研究包括以下2個(gè)方面：

2、 利用DNA重組技術(shù)將基因GhManA2序列以正向，反向構(gòu)建到由纖維特異啟動(dòng)子E6驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體pBI121-E6中，經(jīng)過(guò)SmaI，NotI酶切鑒定和特異引物的PCR擴(kuò)增及測(cè)序證明載體構(gòu)建成功，可用于棉花的遺傳轉(zhuǎn)化。分別以泗棉3號(hào)和W0品系為基因轉(zhuǎn)化受體，將正義、反義GhManA2載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花，共得到53個(gè)愈傷系的500株轉(zhuǎn)化的再生植株。 用NPTⅡ和啟動(dòng)子．目的基因引物對(duì)再生植株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增

3、，初步得到T<,0>代轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性植株230株。正義載體的再生植株中，NPTⅡ基因引物陽(yáng)性率為97.92％，啟動(dòng)子．目的基因引物的陽(yáng)性率為87.23％，反義載體的再生植株中，NPTⅡ基因引物陽(yáng)性率為95.19％，啟動(dòng)子-目的基因引物的陽(yáng)性率為64.65％。只有用NPTⅡ基因引物和啟動(dòng)子-目的基因引物擴(kuò)增結(jié)果都為陽(yáng)性的植株才被初步認(rèn)為是陽(yáng)性植株。本實(shí)驗(yàn)中，一共嫁接了230株陽(yáng)性植株，成活了196株。隨機(jī)取T<,0>代8株P(guān)CR 陽(yáng)性再生植株

4、做Southern雜交。結(jié)果證明NPTⅡ基因已經(jīng)整合到植物基因組中。進(jìn)一步以E6屆動(dòng)子為探針進(jìn)行Southern雜交，有部分植株有特異的雜交信號(hào)說(shuō)明T-DNA區(qū)的E6啟動(dòng)子已整合到棉花基因組中。對(duì)T<,1>、T<,2>代轉(zhuǎn)基因植株提取葉片DNA，用啟動(dòng)子-基因特異引物對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，在檢測(cè)的7個(gè)T<,1>轉(zhuǎn)基因株系中，目的基因的分離比例都符合孟德?tīng)栆粚?duì)基因的分離比例(3：1)，結(jié)合Southern雜交結(jié)果，推測(cè)多拷貝插入的目的基因