石斛蘭試管開(kāi)花及其分子機(jī)制研究.pdf

1、石斛蘭（Dendrobium）是一種具有較高觀賞價(jià)值的熱帶蘭花。本研究以春石斛和鐵皮石斛原球莖為材料，進(jìn)行石斛蘭離體再生體系優(yōu)化、試管開(kāi)花研究，花器官發(fā)育相關(guān)基因LRR-RLK基因克隆及其在試管開(kāi)花過(guò)程中的定量表達(dá)研究。主要結(jié)果如下：
　　 1.石斛蘭離體再生體系的優(yōu)化
　　 以保存5年的春石斛原球莖為材料，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，比較不同NH4+-N:NO3-N比值、6-BA濃度以及香蕉勻漿物濃度對(duì)原球莖增殖的影

2、響，結(jié)果表明：KC+6-BA1.0mg/L+香蕉勻漿物10g/L最適宜春石斛原球莖的增殖，其中香蕉勻漿物對(duì)其影響最大，最適宜的濃度為10g/L;以保存5年的春石斛和鐵皮石斛原球莖為材料，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，比較不同濃度的6-BA、白糖和香蕉（或椰汁）對(duì)其壯苗生根條件的優(yōu)化，結(jié)果表明：香蕉添加物比椰汁更能促進(jìn)春石斛試管苗的壯苗生根，適宜春石斛壯苗生根的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0mg/L+白糖20g/L+香蕉50g/L，而對(duì)于

3、鐵皮石斛，椰汁更有利于其壯苗生根，最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0mg/L+白糖30g/L+椰汁100mL/L更適宜鐵皮石斛試管苗的壯苗生根。
　　 2．石斛蘭試管開(kāi)花研究
　　 從不同培養(yǎng)基、不同濃度6-BA、改良培養(yǎng)基、不同濃度ZT、TDZ、不同濃度馬鈴薯添加物等單因子以及這些因子結(jié)合使用對(duì)春石斛試管苗開(kāi)花的條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：多因子比單因子更容易促進(jìn)春石斛試管苗的開(kāi)花，而且多因子結(jié)合使用更容易獲得正常的試管

4、花，改MS(1/10N，NH4+-N:NO3-N為4:1)+TDZ0.1mg/L+白糖20g/L+CW100mL/L+PP3331.0mg/L，14℃低溫處理20d為春石斛試管苗花芽誘導(dǎo)率最高的處理，誘導(dǎo)率達(dá)到31.91％，NH4+-N:NO3-N、N、TDZ、PP333、糖、椰汁、低溫和PP333對(duì)花芽誘導(dǎo)率的影響均達(dá)到顯著水平，而改MS（1/10N,NH4+-N:NO3-N為2:1,5P）+TDZ0.2mg/L+白糖40g/L+CW

5、100mL/L+PP3331.0mg/L,14℃低溫處理30d為春石斛正常試管花的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，各因素對(duì)其影響程度依次為：糖＞PP333＞低溫＞P＞TDZ=椰汁＞NH4+-N:NO3-N＞N。
　　 從不同濃度的6-BA和TDZ對(duì)鐵皮石斛試管苗花芽誘導(dǎo)的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：TDZ比6-BA更適宜鐵皮石斛試管苗花芽的誘導(dǎo)，最適培養(yǎng)基為1/2MS+TDZ0.2mg/L+CW100mL/L+白糖20mg/L，花芽誘導(dǎo)率最高達(dá)到94

6、.79％（以花芽統(tǒng)計(jì)）和62.50％（以開(kāi)花的試管苗統(tǒng)計(jì)）。
　　 3．春石斛原球莖LRR-RLK基因的克隆以春石斛原球莖為材料，提取總RNA，進(jìn)行春石斛LRR-RLK基因克隆研究。試驗(yàn)結(jié)果表明：使用通用植物總RNA提取試劑盒提取的RNA條帶清晰、明亮，但有DNA污染；改進(jìn)的Trizol試劑法提取的結(jié)果雖不穩(wěn)定，易降解，但無(wú)DNA污染，純度較高，在不同的試驗(yàn)階段應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)要求選擇不同的方法提取石斛蘭總RNA。根據(jù)已有其它植物L(fēng)R

7、R-RLK基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用RT-PCR擴(kuò)增出特異片段，得到了春石斛保守區(qū)和3’端序列，整個(gè)片段長(zhǎng)1034bp，并得到一個(gè)由531個(gè)堿基組成的開(kāi)放閱讀框，編碼176個(gè)氨基酸，通過(guò)核苷酸序列和氨基酸序列的Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)：春石斛LRR-RLK基因的核苷酸序列與已登錄的其它植物L(fēng)RR-RLK基因同源性較高，最高達(dá)到74％；而其編碼的氨基酸序列與多種物種均達(dá)到90％以上。已經(jīng)在GenBank上登錄，登錄號(hào)為GU357498.1。

8、
　　 4．春石斛試管苗開(kāi)花過(guò)程中LRR-RLK基因表達(dá)的熒光定量PCR分析
　　 采用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)春石斛試管苗開(kāi)花過(guò)程中LRR-RLK基因在mRNA水平上的表達(dá)進(jìn)行了定量研究。試驗(yàn)首先克隆了內(nèi)參基因EF-lα，得到了長(zhǎng)716bp的片段，編碼237個(gè)氨基酸序列，通過(guò)核苷酸序列和氨基酸序列的Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)春石斛EF-lα基因的核苷酸序列與已登錄的其它植物EF-lα基因同源性非常高，適宜作為熒光定量表達(dá)過(guò)程中的

9、內(nèi)參基因的待選基因。已經(jīng)在GenBank上登錄，登錄號(hào)為GU382674.1。對(duì)2個(gè)待選內(nèi)參基因EF-lα基因和18SrRNA基因進(jìn)行了篩選比較，結(jié)果表明:18SrRNA更適宜作為春石斛LRR-RLK基因定量表達(dá)分析的內(nèi)參基因。對(duì)春石斛離體開(kāi)花過(guò)程中LRR-RLK基因的定量表達(dá)分析表明：在原球莖階段，LRR-RLK基因表達(dá)量較高，在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)分化成幼苗后逐漸升高，當(dāng)把幼苗轉(zhuǎn)入花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中之后，表達(dá)量逐漸降低，直到形成花芽時(shí)降到