孔雀草試管開(kāi)花條件的優(yōu)化及其分子機(jī)制研究.pdf

1、孔雀草（Tagetes patula L.）屬于菊科萬(wàn)壽菊屬一年生草本植物，是重要的觀賞花卉，有較高的商業(yè)價(jià)值。目前，孔雀草的組培培養(yǎng)研究比較多，但是鮮有試管開(kāi)花方面的報(bào)道，其開(kāi)花機(jī)制研究更少。本研究擬在本試驗(yàn)之前的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)行孔雀草試管苗開(kāi)花條件的優(yōu)化；同時(shí)，克隆與孔雀草試管苗開(kāi)花相關(guān)的AP1基因，并進(jìn)行AP1基因在藍(lán)白光條件下試管開(kāi)花的定量PCR表達(dá)分析，以期為孔雀草試管花卉的開(kāi)發(fā)以及探討試管開(kāi)花的分子機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

2、　　1、孔雀草試管開(kāi)花條件的優(yōu)化
　　將孔雀草種子接種于MS培養(yǎng)基中，在幼苗生長(zhǎng)35 d左右接種于單因素（TDZ、ZT）、隨機(jī)（白糖和KT、白糖和GA3、NAA和GA3）和四因素三水平的正交（PP333、TDZ、ZT、GA3）中，結(jié)果如下：（1）在TDZ濃度為0.03 mg/L時(shí)，可以誘導(dǎo)孔雀草試管開(kāi)花，開(kāi)花率為12%；在ZT濃度為1.0 mg/L時(shí)，有利于花芽的誘導(dǎo)，并且少量的花芽可以試管開(kāi)花。（2）在白糖濃度為45 g/L、K

3、T濃度為0.6 mg/L時(shí)，有利于花芽的誘導(dǎo)，并在部分處理中發(fā)現(xiàn)有試管開(kāi)花現(xiàn)象；在白糖濃度為45 g/L、KT濃度為0.8 mg/L時(shí)，發(fā)現(xiàn)有2株畸形花蕾；在白糖濃度為45 g/L、GA3濃度為0.4 mg/L，花芽數(shù)最多，并在此處理中發(fā)現(xiàn)，1株植株中有11個(gè)花蕾；在NAA濃度為0.05 mg/L、GA3濃度為0.6 mg/L時(shí)，花芽數(shù)最多，并在此處理中發(fā)現(xiàn)有試管開(kāi)花現(xiàn)象。（3）在PP333濃度為0.6 mg/L、TDZ濃度為0.03

4、mg/L、 ZT濃度為1.2 mg/L、GA3濃度為0.5 mg/L時(shí)，有利于花芽的形成，并在此處理中發(fā)現(xiàn)有少量的試管開(kāi)花。同時(shí)發(fā)現(xiàn)有1株植株的花芽數(shù)量達(dá)17個(gè)。（4）藍(lán)光不利于孔雀草試管開(kāi)花，并發(fā)現(xiàn)有白化苗現(xiàn)象。
　　2、孔雀草試管苗葉片AP1基因的克隆
　　本文以孔雀草試管苗葉片為材料，成功克隆了孔雀草的 AP1-1及 AP1-2基因的全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。（1） AP1-1基因全長(zhǎng)919 bp（Ge

5、nBank登錄號(hào)為JX310277），其中5'UTR92 bp、3'UTR149 bp、3'端poly（A）尾巴25 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?78 bp，編碼225個(gè)氨基酸。AP1-1定位于細(xì)胞核中，為親水蛋白，不含信號(hào)肽，共形成4個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，存在亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和一個(gè)MADS-box區(qū)。此蛋白共有7個(gè)磷酸化位點(diǎn)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該蛋白與薔薇科植物的AP1蛋白具有較近的親緣關(guān)系。（2）AP1-2

6、基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?55 bp（GenBank登錄號(hào)為JX310278），編碼185個(gè)氨基酸。AP1-2定位于細(xì)胞質(zhì)中，為親水蛋白，不含信號(hào)肽，共形成4個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，存在亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和一個(gè) K-box區(qū)。此蛋白共有6個(gè)磷酸化位點(diǎn)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該蛋白與薔薇科植物的AP1蛋白具有較近的親緣關(guān)系。
　　3、孔雀草試管苗開(kāi)花過(guò)程中AP1基因表達(dá)qPCR分析
　　以18S為內(nèi)參基因，對(duì)

7、在藍(lán)、白光條件下不同時(shí)期的孔雀草試管苗進(jìn)行AP1基因的熒光定量PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孔雀草試管苗在藍(lán)白光下AP1基因都有表達(dá)。
　?。?）在藍(lán)光條件下，隨著孔雀草的生長(zhǎng)，AP1基因的表達(dá)量逐漸升高，并在壯苗期達(dá)到較高的表達(dá)量。出現(xiàn)花芽時(shí)表達(dá)量開(kāi)始降低，隨著花芽的生長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸升高，并達(dá)到最高。
　　（2）在白光條件下，孔雀草在幼苗期的表達(dá)量和壯苗期的表達(dá)量都較高。隨著花芽的分化，表達(dá)量開(kāi)始降低。并隨著花芽的繼續(xù)生長(zhǎng)，表達(dá)量又開(kāi)