生防煙管菌的分離鑒定、條件優(yōu)化及其作用機(jī)制研究.pdf

1、病原真菌是植物病害最主要的致病因子，并時(shí)常對(duì)農(nóng)作物生產(chǎn)造成毀滅性破壞，最終導(dǎo)致農(nóng)作物大量減產(chǎn)而嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。由于農(nóng)業(yè)防治的不足、抗病性品種的缺失以及化學(xué)農(nóng)藥防治所引起的環(huán)境污染和致病菌抗藥性等問(wèn)題日益嚴(yán)重，具有經(jīng)濟(jì)、高效和環(huán)保等特點(diǎn)的生物防治成為目前植物病害防治的主要技術(shù)手段。然而，生防菌的抑菌能力、抗病范圍及對(duì)不同植物病害、地區(qū)施用環(huán)境的差異，會(huì)限制生物防治的應(yīng)用效果。近年來(lái)，生防真菌由于種類(lèi)多、范圍廣，易分離和開(kāi)發(fā)應(yīng)用，且環(huán)境適

2、應(yīng)性強(qiáng)和抑菌范圍廣等特點(diǎn)在生防微生物中應(yīng)用更為普遍，在防治植物真菌病害中也備受關(guān)注。因此，篩選具有廣譜、高效且穩(wěn)定抑菌效果的生防真菌是植物病害生物防治的一個(gè)新方向。
　　本研究采用平板對(duì)峙試驗(yàn)和搖瓶培養(yǎng)抑菌試驗(yàn)在紫色土壤中篩選獲得一株對(duì)西瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae）、油菜核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）、松立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和柑橘炭疽病菌（Collet

3、otrichum gloeosprioides）均有良好拮抗效果的生防真菌，并進(jìn)一步研究了其對(duì)不同病原真菌的抑菌效果、生理特性、最佳發(fā)酵條件及其生防作用機(jī)制，其結(jié)果如下：
　　1、菌株篩選結(jié)果顯示：分離菌株對(duì)松立枯絲核菌、西瓜蔓枯病菌、柑橘炭疽病菌和油菜核盤(pán)菌的抑菌率分別達(dá)到80.5％、59.6%、65.7%和69.9%；搖瓶培養(yǎng)抑菌試驗(yàn)中的抑菌率則分別為43.4%、49.6%、57.3%和51.8%。根據(jù)菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)特

4、征以及18S rRNA基因序列分析，將其鑒定為煙管菌（Bjerkandera adusta），命名為煙管菌 M-1。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)該菌株對(duì)上述4種病原真菌的生防作用報(bào)道，這也是利用該菌株進(jìn)行植物真菌病害生物防治的又一補(bǔ)充。
　　2、菌株生長(zhǎng)條件的研究結(jié)果表明：菌株M-1可以利用多種碳源和氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，但不能利用尿素為氮源生長(zhǎng)，其中最適碳源為麥芽糖，最適氮源為硝酸鉀。pH試驗(yàn)表明，菌株M-1在酸性、中性和堿性環(huán)境中均能生長(zhǎng)，但在不

5、同pH環(huán)境下生長(zhǎng)情況各不相同，整體呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，在初始pH為7.0時(shí)生長(zhǎng)最好。此外，菌株M-1在15℃~36℃條件下均可生長(zhǎng)，最適溫度為32℃，但在10℃和40℃時(shí)均不能生長(zhǎng)。添加無(wú)機(jī)鹽MgSO4能夠促進(jìn)菌株M-1生長(zhǎng)，而ZnSO4和CuSO4卻能抑制其生長(zhǎng)。
　　3、通過(guò)單因素試驗(yàn)選擇生防菌株最適發(fā)酵條件，研究表明，碳源：對(duì)西瓜蔓枯病菌、油菜核盤(pán)菌和松立枯絲核菌抑菌率最高的碳源均為麥芽糖，而對(duì)柑橘炭疽病菌抑菌率最高時(shí)

6、的碳源為葡萄糖。菌株最適發(fā)酵氮源為硝酸銨，而 C/N為6.0:1~8.4:1時(shí)對(duì)4種病原真菌的抑制效果較好，其中最適C/N為7.2:1。發(fā)酵液最適碳源用量均為20g/L。pH：對(duì)西瓜蔓枯病菌、油菜核盤(pán)菌、松立枯絲核菌和柑橘炭疽病菌抑菌效果最好的pH分別為9.0、5.0、7.0和9.0。溫度：對(duì)西瓜蔓枯病菌和松立枯絲核菌抑菌率最高時(shí)的發(fā)酵溫度均為30℃，而對(duì)油菜核盤(pán)菌和柑橘炭疽病菌為25℃。裝液量：對(duì)松立枯絲核菌抑菌率的最佳裝瓶量為45%

7、（v/v），而對(duì)另外3種病原真菌的最佳裝瓶量為30%。轉(zhuǎn)速及時(shí)間：菌株M-1液體發(fā)酵的最適轉(zhuǎn)速為180r/min，最適發(fā)酵時(shí)間均為20d。菌株M-1發(fā)酵液在80℃水浴處理后抑菌率仍在19.3%以上，而100℃處理后抑菌率也在15%左右，其發(fā)酵液表現(xiàn)出一定的熱穩(wěn)定性，但是以40℃時(shí)效果最好。
　　4、采用響應(yīng)曲面法對(duì)菌株M-1發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了最優(yōu)條件組合。其中，對(duì)西瓜蔓枯病菌抑制作用最佳的發(fā)酵條件是：C/N為7.1，pH為7

8、.4，裝瓶量為44%，時(shí)間為19d，轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度為29℃，抑菌率可由49.6%提升至52.6%；對(duì)油菜核盤(pán)菌抑制效果最好的發(fā)酵條件：C/N為7.5，pH為4.7，裝瓶量為33%，時(shí)間為22d，轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度為32℃，優(yōu)化后其發(fā)酵液抑菌率可以由51.8%增加到80.9%；對(duì)柑橘炭疽病菌抑制效果最好的發(fā)酵條件：C/N為7.5， pH為6.5，裝瓶量為36%，時(shí)間為22d，轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度為30℃，此

9、時(shí)的抑菌率能夠達(dá)到71.1%；對(duì)松立枯絲核菌抑制效果最好的發(fā)酵條件：C/N為10.0， pH為5.0，裝瓶量為58%，時(shí)間為30d，轉(zhuǎn)速為140r/min，溫度為35℃，此時(shí)的抑菌率可高達(dá)91.8%。優(yōu)化后發(fā)酵液的抑菌活性均有所提高，為該菌株的實(shí)踐生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。
　　5、生防菌株重寄生作用機(jī)制的研究顯示：在掃描電鏡下清晰地觀察到菌株M-1菌絲直接穿插、刺透油菜核盤(pán)菌菌絲，使后者菌絲膨大、變形甚至破裂，而且也可直接穿透西瓜蔓枯

10、病菌的菌絲。因此，煙管菌 M-1對(duì)油菜核盤(pán)菌和西瓜蔓枯病菌的重寄生作用是通過(guò)直接穿插、刺透和裂解病原真菌菌絲實(shí)現(xiàn)的，該機(jī)制也是生防菌重要的作用機(jī)制之一。
　　6、盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明：菌株M-1對(duì)西瓜蔓枯病菌和油菜核盤(pán)菌的病情指數(shù)分別為8.4和10.7，對(duì)黃瓜植株和油菜植株的防病效果分別達(dá)到74.3%和71.4%，均高于農(nóng)藥對(duì)照，表現(xiàn)出很好的防病效果。菌株 M-1對(duì)黃瓜植株和油菜植株抗病性相關(guān)酶活性的增加均有不同程度地促進(jìn)作用，對(duì)其葉