煙草土傳青枯病生防菌Bacillus amyloliquefaciens SQR11的分離、鑒定及其相關生防機制的研究.pdf

1、煙草青枯病是一種由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum，RS）引起的并可通過土壤進行傳播的細菌性病害，嚴重威脅著我國煙草生長及煙葉的品質，造成巨大的經(jīng)濟損失。常規(guī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所使用的防治方法存在多種弊端，根際細菌介導的生物防治開始成為一種新的有效方法。將篩選獲得的高效功能性微生物加入到有機肥中，通過固體發(fā)酵技術，制成生物有機肥運用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，不僅達到防控病害的目的，更能夠保護環(huán)境，減少化肥、農(nóng)藥污染，還能夠提高肥效，

2、實現(xiàn)綠色農(nóng)業(yè)。
　　 本研究主要利用平板梯度稀釋涂布、平板對峙等方法篩選對煙草土傳青枯病具有高效拮抗能力的菌株，通過復篩獲得高效的煙草青枯病拮抗菌;生理生化實驗結合16SrRNA序列鑒定高效拮抗菌;對其含有的抗生素合成基因進行PCR檢測，對產(chǎn)拮抗物質的條件、拮抗物質的理化性質進行了初步研究;利用連續(xù)溫室盆栽實驗對拮抗菌株的生防能力進行了檢測，驗證所選菌株的生防能力;針對第三季盆栽實驗的結果，對各處理組發(fā)病/未發(fā)病植株各部分組織及

3、根際土、土體土進行隨機采樣，分別檢測了其中病原菌、拮抗菌的數(shù)量，依據(jù)相對數(shù)量的變化進行初步生防機制的研究。在獲得較好生防效果的前提下，進一步考慮改進固體發(fā)酵方法，初步嘗試了不同發(fā)酵基質對功能細菌增殖的影響。具體研究結果分述如下:
　　 (1)本試驗先后共分離得到30余株菌落形態(tài)不同的菌株，通過初篩、復篩得到5株拮抗能力強且效果穩(wěn)定的芽孢桿菌，分別命名為SQR11、SQR33、SQR55、SQR99、SQR110。將上述菌株分別制

4、成生物有機肥后，進行初步盆栽實驗檢驗各菌株的生防效果，其中菌株SQR11的生防效果最好，第一季盆栽的生防指數(shù)在47％以上，其它菌株除SQR33達到45％左右外，剩余均不到30％。
　　 (2)菌株形態(tài)觀察、生理生化試驗結合16S rRNA基因同源性序列比對分析等鑒定手段，將菌株SQR11鑒定為解淀粉芽孢桿菌。
　　 (3)解淀粉芽孢桿菌SQR11產(chǎn)拮抗物質最佳條件為:甘露醇10 g、蛋白胨30 g、MgSO42.0g、K

5、2HPO41.0g、pH7.0，去離子水1 L;在1/5裝瓶量，190 rpm，30℃條件下培養(yǎng)48 h。
　　 (4)利用乙酸乙酯從Bacillus amyloliquefaciens SQR11發(fā)酵液中萃取得到的粗提物對茄科勞爾氏菌具有顯著的抑制效果，且熱穩(wěn)定性比較好，80℃高溫處理2h后抑菌圈無明顯變化;同時拮抗物質對紫外線表現(xiàn)良好的穩(wěn)定性。其粗提物在pH2.0～9.0范圍內(nèi)拮抗活性較穩(wěn)定，而對強堿性條件比較敏感;蛋白酶K

6、和胃蛋白酶對拮抗物質活性沒有明顯抑制作用，而胰蛋白酶能夠在一定條件下將拮抗物質降解。
　　 (5)根據(jù)第一批盆栽實驗結果，對SQR11菌株進行第二季、第三季連續(xù)盆栽實驗，驗證其生防效果的穩(wěn)定性。三季盆栽生防結果為:第一季47％，第二季69％，第三季達到89％。盆栽實驗結果表明，解淀粉芽孢桿菌SQR11具有顯著防控煙草土傳青枯病的能力。
　　 (6) Bacillus amyloliquefaciens SQR11的第三季

7、盆栽實驗結果表明，當植株根際土中病原菌數(shù)量達到2×105CFU/g(干重)時，植株出現(xiàn)發(fā)病癥狀，隨著病原菌數(shù)量的增加，發(fā)病癥狀加重。當根際土中拮抗菌活菌數(shù)量達到2×107(干重)時，病原菌繁殖得到有效抑制，可有效阻止植株染病;若低于107，則不能有效抑制病原菌增殖，植株表現(xiàn)發(fā)病癥狀。植株各組織內(nèi)拮抗菌數(shù)量檢測發(fā)現(xiàn)，未發(fā)病植株莖部拮抗細菌數(shù)量為4×104(干重)左右，而同處理中發(fā)病癥狀的植株僅為6×103;相對應的病原菌數(shù)量分別為1.5×

8、102(干重，健康植株)、3×103(干重，發(fā)病植株)。同時，生物有機肥處理組植株生物量較化肥組增加了50％左右。由此證明，SQR11與茄科勞爾氏菌Ralstoniasolanacearum之間存在明顯的生物抑制作用，且SQR11制成的生物有機肥對煙草生長具有一定的生物促生作用。
　　 (7)利用羽毛粉、菜粕氨基酸、未腐熟菜粕、豬糞、藻泥實驗室現(xiàn)有的有機質進行初步固體發(fā)酵優(yōu)化實驗，結果表明，使用豬糞、羽毛粉、菜粕氨基酸有機質組進

9、行固體發(fā)酵獲得的生物有機肥產(chǎn)品中菌株SQR11數(shù)量最多，達到2×108 CFU/g(干重)，并能夠長期穩(wěn)定存在，肥效實驗也表明該發(fā)酵產(chǎn)品比化肥處理具有明顯的促進作用。
　　 (8)對Bacillus amyloliquefaciens SQR11的拮抗基因進行了檢測，結果表明SQR11基因組中存在surfactin、 iturin等物質的合成基因。在拮抗物質分離鑒定過程中，通過高效液相色譜分析初步確定存在以上兩類物質。