馬鈴薯甲蟲的蟲生真菌分離及其生防菌的篩選鑒定.pdf

1、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata(Say)是重要的外來入侵物種和檢疫性害蟲，國外已開發(fā)出多殺菌素等防治馬鈴薯甲蟲的生物殺蟲劑，但由于馬鈴薯甲蟲傳入我國不久，對其致病微生物的研究國內(nèi)尚未見報(bào)道。因此本研究從新疆馬鈴薯甲蟲發(fā)生地采集感病成蟲樣品，在室內(nèi)分離昆蟲病原菌，并經(jīng)致病性測定篩選出2個強(qiáng)致病白僵菌菌株，用形態(tài)及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定強(qiáng)致病菌，并研究它們的培養(yǎng)特性，最后進(jìn)行溫室盆栽和大田試驗(yàn)測定這2個菌株的防治效

2、果。
　　 馬鈴薯甲蟲病原菌的分離：從新疆大量采集感病馬鈴薯甲蟲，采用常規(guī)昆蟲真菌分離法從蟲體上分離純化后獲得47個真菌菌株，初步形態(tài)學(xué)鑒定分別屬于白僵菌(Beauveria)、輪枝菌(Verticillium)、鐮刀菌(Fusarium)、青霉(Penicillim)、木霉(Trichoderma)和曲霉(Aspergillus)屬等。
　　 不同菌株對家蠶的致病性測定：用真菌懸浮液(濃度：1.05×109個/mL)接

3、種家蠶2齡幼蟲，結(jié)果表明有36個菌株對家蠶有不同程度的致病性，其中白僵菌30株、輪枝菌3株、鐮刀菌2株和木霉1株，白僵菌菌株中MJ-07的致病力最強(qiáng)，接種后11d的累積死亡率達(dá)到95.6％，致死中時(LT50)為7.5d；輪枝菌MJ-20接種后11d的累積死亡率和LT50分別為61.5％和9.1d；鐮刀菌MJ-27和木霉MJ-32的致病力較弱，其接種11d的累積死亡率僅為8.6～11.0％。
　　 本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步到新疆進(jìn)行馬

4、鈴薯甲蟲致病性測定奠定了基礎(chǔ)，同時也為今后有關(guān)地區(qū)在應(yīng)用病原菌控制馬鈴薯甲蟲時注意保證養(yǎng)蠶業(yè)的安全提出了警示。真菌菌株對馬鈴薯甲蟲的致病性：用家蠶初步篩選獲得的36個菌株的分生孢子懸浮液(濃度：1.1×109個/mL)分別接種馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲后觀察，它們都具有不同程度的致病力。輪枝菌(Verticillium)、鐮刀菌(Fusarium)和木霉(Trichoderma)菌株的致病力比較弱，接菌9d后的蟲體累計(jì)死亡率(LR9d)只有4.

5、3～11.3％。多數(shù)白僵菌Beauveria)菌株的致病力都較強(qiáng)，其中有5株白僵菌(MJ-01、MJ-03、MJ-07、MJ-08、MJ-09)的致病力非常強(qiáng)，LR9d達(dá)到82.3～93.3％，致死中時(LT50)和致死中濃度(LC50)分別為6.71～7.53d和4.53×106-5.89×107mL-1。選擇致病力最強(qiáng)的MJ-07和MJ-09菌株作進(jìn)一步試驗(yàn)，觀察它們對成蟲和各齡幼蟲的致病性。結(jié)果表明，MJ-07菌株對1齡、2齡幼蟲

6、和成蟲的致病性都很強(qiáng)，接菌后5d初見蟲體死亡，LR9d分別為100％、93.4％和98.0％；而對3齡和4齡幼蟲的致病性相對較弱，LR9d各為70.0％和43.3％；死亡的蟲體縮小，后期產(chǎn)生大量分生孢子完全包被蟲體。MJ-09對1齡和2齡幼蟲的致病性很強(qiáng)，接菌后5d始見蟲體死亡，LR9d分別達(dá)100％和90.0％；而對3齡和4齡幼蟲和成蟲的致病性較弱，接種后7d才開始見蟲體死亡，LR9d分別只有63.3％、33.0％和13.3％；剛死亡

7、的蟲體完全變黑，后期產(chǎn)生的分生孢子量不如MJ-07致死的蟲體產(chǎn)孢量大，不能完全包被蟲體。
　　 本研究結(jié)果認(rèn)為，MJ-07和MJ-09是馬鈴薯甲蟲的強(qiáng)致病力菌株，在馬鈴薯甲蟲的生物控制中將具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。菌株MJ-07和MJ-09對馬鈴薯甲蟲的控制效果測定：通過前期室內(nèi)致病性試驗(yàn)，選致病性最強(qiáng)的2株白僵菌(MJ-07和MJ-09)進(jìn)行室內(nèi)盆栽和田間防效試驗(yàn)。
　　 1.室內(nèi)盆栽結(jié)果表明，2個菌株對1齡和2齡幼蟲的

8、致死率顯著高于3齡幼蟲，噴施MJ-07菌懸液15d后的各齡幼蟲的死亡率分別為65.5％、61.8％和30％；而噴施MJ-09菌懸液15d后的死亡率分別為62.3％、57.2％和25％。
　　 2.選擇1齡和2齡CPB幼蟲進(jìn)行田間試驗(yàn)，噴施MJ-07菌懸液15d后的死蟲率分別為45％和41.6％；噴施MJ-09菌懸液15d后的死蟲率分別為40.2％和38.3％；作為對照白僵菌制劑的致死率僅有30％，2個菌株的田間致病性高于對照白僵

9、菌制劑，表現(xiàn)出很好的害蟲控制效果。
　　 白僵菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定：在SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落呈茸毛狀，MJ-07培養(yǎng)初期多呈白色且菌落較厚，MJ-09菌落淡黃色，背面無色，或淡黃色。氣生菌絲透明、光滑、薄壁，分枝較少且較纖細(xì)，寬1.8～2.8μm；分生孢子梗著生在菌絲上，粗1～2μm，產(chǎn)孢細(xì)胞常著生于短的并稍有膨大的柄細(xì)胞上，常呈濃密的菌叢，基部多為球形、近球形至梭形膨大；產(chǎn)孢軸較長，呈“之”字形彎曲。分生孢子單孢、壁薄、

10、透明、光滑，多為球形、近球形，直徑2～3×2～2.5μm。采用真菌通用引物對(ITS4和ITS5)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分別對菌株MJ-07和MJ-09的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA ITS)的特異性擴(kuò)增，得到了長度分別為581bp和537bp的特異性片段(GenBank登錄號分別為GU233851和GU989641)，Blast比對后結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定它們的無性時期均為球孢白僵菌(Beauveria bassiana)，

11、有性時期為球孢蟲草菌(Cordyceps bassiana)。
　　 白僵菌菌株主要培養(yǎng)特性：在供試的8種培養(yǎng)基中，SDAY培養(yǎng)基最適MJ-07和MJ-09菌株生長，其產(chǎn)孢強(qiáng)度也最大；6個溫度處理中最適生長溫度為25℃，孢子萌發(fā)最適溫度25～28℃；菌株在供試的9種碳源和9種氮源中，對葡萄糖和蔗糖2種碳源及胰蛋白胨和酵母浸膏2種氮源利用最好；菌株在全光照條件下菌絲生長最好及產(chǎn)孢量最大；分生孢子的致死條件為55℃處理10min；紫

12、外光照射對分生孢子萌發(fā)有顯著影響，照射60min時，24h內(nèi)沒有孢子萌發(fā)；分生孢子在2％葡萄糖+1％蛋白胨培養(yǎng)基中萌發(fā)最早。5種常用馬鈴薯甲蟲殺蟲劑對MJ-07和MJ-09生長產(chǎn)孢的試驗(yàn)結(jié)果顯示，5種供試殺蟲劑對2個菌株的菌落生長和孢子萌發(fā)均有不同程度的抑制作用。其中高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉對2個菌株的抑制作用較小，對MJ-07的孢子萌發(fā)抑制率分別為9.5％和13.5％，對MJ-09孢子萌發(fā)率分別為10.9％和13.3％；而滅多威、啶蟲脒