馬鈴薯甲蟲生防細(xì)菌的篩選與鑒定.pdf

1、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata(Say))是我國重要的進(jìn)境植物檢疫性有害生物，國外已成功開發(fā)出基于蘇云金桿菌和刺糖多孢菌的細(xì)菌性殺蟲劑，而國內(nèi)利用病原細(xì)菌等微生物防治該蟲的研究報道很少。本研究從新疆疫區(qū)采集田間自然死亡的馬鈴薯甲蟲標(biāo)本，在室內(nèi)分離昆蟲病原細(xì)菌，經(jīng)致病性試驗(yàn)篩選出具有潛在開發(fā)應(yīng)用價值的生防菌并對強(qiáng)致病菌進(jìn)行鑒定，研究生防菌的培養(yǎng)特性以及生防細(xì)菌與蟲生真菌對馬鈴薯甲蟲的協(xié)同控制效果。
　　

2、 1.馬鈴薯甲蟲病原細(xì)菌分離及其降解酶活性測定:從新疆馬鈴薯甲蟲疫區(qū)采集的發(fā)病馬鈴薯甲蟲上分離純化得到126個細(xì)菌菌株。其中能降解幾丁質(zhì)的20株，能降解蛋白質(zhì)的26株，能同時降解這兩種物質(zhì)的10株，初步認(rèn)為這些具降解酶活性的菌株可能是馬鈴薯甲蟲的病原細(xì)菌，初步確定它們均為芽孢桿菌屬(Bacillus)的細(xì)菌。
　　 2.具降解酶活性菌株對家蠶的致病性測定:用具降解酶活性的36個菌株的細(xì)胞懸浮液(濃度:2.0×109cfu/mL

3、)接種2齡家蠶幼蟲。結(jié)果表明，有21個菌株表現(xiàn)出致病性，其中8個菌株致病力較強(qiáng)，接種后1-2d就出現(xiàn)蠶體死亡，接種7d的累積死亡率(LR7d)達(dá)50％以上，致死中時(LT50)都小于7.4d，菌株CPB008、CPB012、CPB016致病力最強(qiáng)，LR7d達(dá)70％以上，LT50分別為3.2d、3.3d和3.6d，這為后期進(jìn)行馬鈴薯甲蟲生防菌的篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.昆蟲病原細(xì)菌對馬鈴薯甲蟲的致病性測定:用對家蠶有致病性的21

4、個菌株的細(xì)胞懸浮液(濃度:2.0×109cfu/mL)接種各齡馬鈴薯甲蟲后觀察。有11個菌株對1、2齡幼蟲具有致病性，其中6個菌株對1齡幼蟲致病力非常強(qiáng)，接種后1-2d蟲體開始死亡，LR7d達(dá)50％以上，LT50為3.8-6.8d，致死中濃度(LC50)為0.088-2.555×109cfu/mL，CPB008、CPB012和CPB016對1齡幼蟲的致病性最強(qiáng)，LR7d達(dá)70％以上，LT50分別為3.8d、4.1d和4.3d，LC50分

5、別為0.088、0.383和0.316×109cfu/mL:所有菌株對2齡幼蟲的致病性稍弱，LR7d為21.0-62.6％，LT50為4.1-10.3d，但CPB008、CPB012和CPB016菌株的LR7d仍超過50％。由這些細(xì)菌致死的馬鈴薯甲蟲蟲體變黑腐爛，有的有褐色液體流出，通過柯赫氏法則驗(yàn)證它們均為馬鈴薯甲蟲的病原細(xì)菌。本研究結(jié)果認(rèn)為，菌株CPB008、CPB012、CPB016、CPB072、CPB108和CPB111是馬鈴

6、薯甲蟲的強(qiáng)致病菌，其中CPB008、CPB012和CPB016在馬鈴薯甲蟲的生物控制中將具有巨大的開發(fā)應(yīng)用價值。
　　 4.強(qiáng)致病菌株對馬鈴薯甲蟲的田間控制效果及生防菌篩選:以前期試驗(yàn)篩選的6個強(qiáng)致病菌株為供試菌株，1齡馬鈴薯甲蟲為供試?yán)ハx，清水和常用Bt制劑為對照進(jìn)行田間試驗(yàn)。結(jié)果表明，有3個菌株在接種10d后的累計死亡率(LR10d)達(dá)到40％以上，分別是CPB008(49.9％)、CPB012(43.1％)和CPB016(

7、41.0％);另外3個菌株在田間對1齡幼蟲的LR10d分別為37.5％(CPB108)、28.4％(CPB072)和21.1％(CPB111)，而作為對照的Bt制劑對1齡幼蟲的致死率僅有24.9％，顯著低于除菌株CPB111以外的供試菌株，6個菌株表現(xiàn)出較好的田間防治效果，CPB008、CPB012和CPB016的防治效果最好，確定為馬鈴薯甲蟲的生防細(xì)菌。
　　 5.強(qiáng)致病病原細(xì)菌的鑒定:1）.形態(tài)學(xué)觀察:6株病原細(xì)菌在LB培養(yǎng)

8、基上單胞菌落為乳白色;革蘭氏染色陽性;菌體桿狀，在細(xì)胞的一端形成芽孢，芽孢染色為綠色。其中CPB008、CPB012、CPB016和CPB111的單胞菌落圓形，邊緣不整齊;菌體長形，兩端鈍圓與中部同樣大小;菌體大小為1.17-1.94×6.12-7.24μm;菌株CPB072和CPB108單胞菌落圓形或近圓形，邊緣整齊;菌體中間粗兩端略尖;菌體大小為1.79-2.4×6.32-7.29μm。2）.生理生化特性:6個菌株都能利用D-葡萄糖

9、、D-果糖、甘露醇、NH4H2PO4和KNO3，而不能利用D-木糖;接觸酶反應(yīng)、淀粉水解、V-P試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)均呈陽性，吲哚試驗(yàn)呈陰性，都不產(chǎn)生H2S;在2％NaCl的鹽濃度和30、37℃下生長良好。3).16SrDNA序列分析:采用細(xì)菌16SrDNA通用引物，以6個菌株的基因組DNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1012-1268bp的16SrDNA核心序列(GenBank登錄號分別為:JF795483.(CPB008)、JN89

10、6990(CPB012)、JN896992(CPB016)、JN896991(CPB072)、JF505384(CPB108)和JN896993(CPB111))。4).鑒定:結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特性和分子生物學(xué)方法，CPB008、CPB012、CPB016和CPB111鑒定為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，CPB072和CPB108鑒定為萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus）。
　　 6.生防菌

11、株的培養(yǎng)特性:在供試的8種培養(yǎng)基中，CPB008、CPB012和CPB016的最適培養(yǎng)基分別為LB、NA和NA培養(yǎng)基;3個菌株的最適生長pH、溫度和鹽濃度分別為7.0、37℃和2％NaCl;在供試的8種碳源和氮源中，菌株對葡萄糖碳源和蛋白胨氮源利用最好;3個菌株的生長特性基本一致，0-2h處于延滯期，2-16h為對數(shù)生長期，16h后處于穩(wěn)定期。
　　 7.生防細(xì)菌CPB008與白僵菌MJ-07的協(xié)同殺蟲效果:試驗(yàn)結(jié)果表明，MJ-

12、07+CPB008顯著提高了對馬鈴薯甲蟲的控制效果。室內(nèi)接種后，MJ-07+CPB008引起蟲體始見死亡時間提前3d;對1齡和2齡幼蟲的LR14d達(dá)到95％以上，對3、4齡幼蟲的LR14d也超過了60％;且幼蟲體重增長緩慢，所需發(fā)育時間長;田間接種2周后調(diào)查，對1齡和2齡幼蟲的防治效果分別達(dá)到45.2％和42.2％，作為對照的Bt制劑分別只有24.9％和23.2％。
　　 昆蟲病原細(xì)菌是自然界中廣泛分布的一類寶貴的生物資源，隨著