駿棗內生細菌的分離、鑒定與拮抗菌的篩選.pdf

1、目的：
　　 本研究以交城駿棗為實驗材料，用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和克隆文庫構建的方法研究交城駿棗內生細菌種群多樣性;找出一組較適合應用于植物內生細菌分離的培養(yǎng)基;并篩選出能夠拮抗多種植物病原菌和人體致病菌的內生細菌。
　　 方法：
　　 1、培養(yǎng)基的選擇:對分離內生細菌的常用培養(yǎng)基，如胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、任氏培養(yǎng)基(R2A)、金氏培養(yǎng)基B(KMB)、肉汁胨培養(yǎng)基(BPA)、LB培養(yǎng)基、酵母膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(Y

2、PM)、無氮培養(yǎng)基進行選擇，以使其能最大限度的分離大棗中的內生細菌。
　　 2、內生細菌的分離及鑒定:采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離出紅棗的內生細菌，并對其形態(tài)特征和主要生理生化特性，如接觸酶、氧化酶、淀粉水解、硝酸鹽還原、吲哚反應、V-P實驗、耐鹽性、最高耐受溫度等進行測定。通過16SrDNA序列測定結果結合生理生化特征對內生細菌做出初步鑒定。
　　 3、拮抗菌的篩選:采用平板對峙法篩選出多種對植物病原菌和人體致病菌有抑菌活性的

3、內生細菌。
　　 4、克隆文庫的方法研究成熟健康大棗內生細菌的多樣性:①表面滅菌;②大棗基因組DNA的提取;③PCR擴增并切膠純化;④克隆建庫;⑤酶切分型;⑥代表條帶的測序;⑦多樣性分析。
　　 結果：
　　 1、將大棗組織稀釋到104-106倍較適合內生菌的分離，本實驗選擇的7種分離培養(yǎng)基中KMB培養(yǎng)基和無氮培養(yǎng)基分離內生菌的效果最好。
　　 2、采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法從紅棗中分離到16株內生細菌和2株內生真

4、菌，經(jīng)初步鑒定，細菌包括芽孢桿菌（Bacillussp.）、Lysinibacillus菌（Lysinibacillussp.）、葡萄球菌(Staphylococcussp.)、多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）、紅球菌(Rhodococcussp.)、庫克菌(Kocuriasp.)、節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、微球菌（Micrococcussp.）、不動桿菌(Acinetobactersp.)。

5、
　　 3、通過對峙實驗從紅棗內生細菌中篩選出5株對多種植物病原真菌和人體致病菌有拮抗作用的細菌，分別為不動桿菌(Acinetobactersp.)、節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、Lysinibacillus菌（Lysinibacillussp.）、多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）。
　　 4、構建克隆文庫，得到陽性克隆151個，劃分為15個OTUs（操作分類單元），經(jīng)過16SrD

6、NA片段測序，有42個克隆屬于大腸桿菌(E.coli)，代表了3個OTUs，在該文庫中占總克隆數(shù)的27.8％。有28個克隆屬于蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，代表了2個OTUs，在該文庫中占總克隆數(shù)的18.5%。有23個克隆屬于類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)，代表了3個OTUs，在該文庫中占總克隆數(shù)的15.2%。這三個類屬于該克隆文庫的優(yōu)勢種群。
　　 結論：
　　 1、紅棗內分布有大量內生