香蕉嗜鐵內(nèi)生細(xì)菌BEB3的分離鑒定及其生防機(jī)理初探.pdf

1、本試驗(yàn)從中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所香蕉種質(zhì)圃的19份香蕉種質(zhì)中分離得到71份香蕉內(nèi)生細(xì)菌,其中GCTCV106和TMBX1378兩份種質(zhì)內(nèi)生菌含量最高,均達(dá)到1×106 cfu/g,最少的臺(tái)蕉3號(hào)也有1×104 cfu/g。經(jīng)過(guò)體外活性評(píng)價(jià),篩選出對(duì)香蕉枯萎病4號(hào)生理小種(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC4)具有一定拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌分離物6份,占總分離物的8.45％,其中一株BEB3

2、拮抗效果最好。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA分子鑒定,確定該菌為勞爾氏菌屬(Ralstonia sp.),與Ralstonia mannitolilytica(甘露醇羅爾斯頓菌)相似性最高達(dá)99.6％。
　　 采用利福平梯度誘導(dǎo)篩選,獲得BEB3抗利福平200μg/ml的突變株。通過(guò)接合轉(zhuǎn)移將帶有GFP基因的自殺性質(zhì)粒pJBA28轉(zhuǎn)到BEB3菌株中,挑選能在雙抗平板上生長(zhǎng)的克隆子,經(jīng)PCR檢測(cè)、熒光共聚焦觀察和South

3、ern雜交分析,獲得陽(yáng)性克隆子。用浸根的方法對(duì)香蕉組培苗進(jìn)行回接,分別提取種植10 d、20 d、30 d的香蕉沙床苗的DNA,用PCR進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)帶有GFP標(biāo)記的BEB3菌株已經(jīng)定殖在香蕉植株內(nèi)。
　　 用CAS固體平板檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BEB3產(chǎn)鐵載體,并對(duì)該菌進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定,該菌的最佳生長(zhǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)為:4 g葡萄糖,4g酸水解酪蛋白,0.5 ml的1 mol/L MgCl2,1 ml

4、的1 mol/L CaCl2。而產(chǎn)鐵載體的最佳培養(yǎng)基為:1 g葡萄糖,1 g酸水解酪蛋白,0.5 ml/L的1 mol/L MgCl2,1 ml/L的1 mol/LCaCl2。綜合發(fā)酵成本、該菌生長(zhǎng)量及鐵載體產(chǎn)量可知,該菌較優(yōu)的培養(yǎng)條件為:150 ml三角瓶中裝液50 ml,起始pH6.5,接種量7％,起始鐵離子濃度0.4 mg/L。
　　 對(duì)內(nèi)生菌BEB3抗病性評(píng)價(jià)的初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):該菌的無(wú)菌濾液對(duì)鐮刀菌孢子萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)