玉米內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及抗真菌活性物質(zhì)的研究.pdf

1、分類號(hào)：Q窆3里：里2密級(jí)：公玨單位代碼：學(xué)號(hào)：100862009109玉米內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及抗真菌活性物質(zhì)的研究IdentificationandAntifungalActivitySubstancesofEndophyticBacteriafromMaize學(xué)位申請(qǐng)人：候美玲指導(dǎo)教師：董金皋教授郝志敏副教授學(xué)科專業(yè)：微生物與生化藥學(xué)學(xué)位類別：理學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一二年五月二十九日摘要玉米大斑病是重要的玉米葉

2、部病害之一，引起該病的病原菌為玉米大斑病菌(SetDs力辦口Pr砌turcica)，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)會(huì)極大地影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前防治大斑病主要是利用抗病品種，并輔以適當(dāng)?shù)乃巹┓乐?。但由于抗病品種的單一大面積應(yīng)用往往導(dǎo)致抗性迅速喪失，化學(xué)藥劑使用又常常帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)面影響。因此，尋求新的病害防治途徑勢(shì)在必行。利用植物內(nèi)生菌對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，本研究從健康玉米植株?nèi)分離得到22株內(nèi)生細(xì)菌，進(jìn)一步篩選得到1株對(duì)玉米大斑病菌

3、具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌YYl菌株，經(jīng)對(duì)其生物學(xué)特性、抗菌性能、抗菌物質(zhì)及抗菌機(jī)理進(jìn)行分析與研究，獲得以下主要結(jié)果：1從健康玉米葉片中分離出的1株對(duì)玉米大斑病菌具有較好拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌菌株～YYl，該菌株有較廣的抗菌譜，通過(guò)分生孢子懸浮液噴霧法檢測(cè)YYl菌株的生防效果，發(fā)現(xiàn)濃度為2104個(gè)／mL的孢子懸浮液與YYl菌株發(fā)酵液等比例混合液，對(duì)玉米大斑病菌具有較好的抑制作用。通過(guò)形態(tài)觀察，生理生化反應(yīng)及16SrDNA基因序列比對(duì)，鑒定YYl

4、菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。2研究了YYl菌株的最佳發(fā)酵條件，即可溶性淀粉30％、蛋白胨20％、KH2P04002％、MnCl2001％，培養(yǎng)基初始pH90，培養(yǎng)基裝液量30mL／250mL，接種量4％，28。C120rpm搖床振蕩培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，發(fā)酵液對(duì)玉米大斑病菌的抑菌活性在30h時(shí)幾乎升高1倍。3對(duì)YYl菌株分泌的抗菌蛋白粗提液的抑菌機(jī)理進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)粗蛋白處理后致使玉米大斑病菌

5、基內(nèi)菌絲由絲狀變?yōu)榇闋睿划?dāng)粗蛋白濃度為O78∥此時(shí)，分生孢子萌發(fā)完全受抑制，原生質(zhì)體裂解。孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中，cAMP信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)降低，且相關(guān)基因突變菌株抑制率亦降低，推測(cè)抑菌的分子機(jī)理可能與cAMP信號(hào)途徑有關(guān)。4抗菌粗蛋白對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶不敏感，重金屬Cr3可使蛋白完全失活，并且pH活性范圍較寬，在pH6～11范圍內(nèi)抑菌活性強(qiáng)，在堿性條件下穩(wěn)定，在強(qiáng)酸性條件下抑菌活性幾乎消失。粗蛋白經(jīng)分離純化并進(jìn)行SDSPAGE檢

6、測(cè)得到單一蛋白條帶YYl036，分子量約為30kD，經(jīng)MALDITOFMS分析發(fā)現(xiàn)該蛋白與烯酰輔酶A水解酶(enoylCoAhydratase)的匹配度最高。5采用高速逆流色譜(HSCCC)對(duì)菌株YYl分泌的脂肽類抗菌物質(zhì)進(jìn)行分析，確定HSCCC最佳條件：檢測(cè)波長(zhǎng)為214nin，溶劑體系為乙酸乙酯：正丁醇：水(4：1：5)。經(jīng)HSCCC后生測(cè)發(fā)現(xiàn)第9個(gè)組分對(duì)玉米大斑病菌有很強(qiáng)的抑菌活性，該組分的保留時(shí)間為113～115min，進(jìn)一步經(jīng)H