土傳煙草青枯病的生物防控及其機(jī)理研究.pdf

1、煙草青枯病由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起，在我國長江流域及西南煙區(qū)普遍發(fā)生，危害嚴(yán)重，造成煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)降低甚至絕收。青枯病已經(jīng)成為我國煙草生產(chǎn)上的主要限制因子之一。本研究主要從寄主-病原-環(huán)境三者生態(tài)互作角度出發(fā)，針對(duì)煙草青枯病的發(fā)生機(jī)理，運(yùn)用生物防控和生物修復(fù)的手段防控青枯病的發(fā)生，并從拮抗菌在根系形成的生物保護(hù)膜和根系分泌物對(duì)病原菌與拮抗菌生長的促進(jìn)與抑制作用兩方面著重闡述了青枯病生物防控機(jī)理。

2、
　　 從煙草青枯病發(fā)生嚴(yán)重的田間根際土壤及病株中采用茄科勞爾氏菌選擇性培養(yǎng)基分離、篩選到青枯病病原菌119株。通過菌落形態(tài)、生理生化和16S rRNA基因序列分析，并結(jié)合病原菌回接實(shí)驗(yàn)，鑒定其中一株為茄科勞爾氏菌煙草?；椭虏⌒停≧alstonia solanacearum E.F.Smith f.sp.nicotianae，Rs）。通過分別改變土壤病原菌數(shù)量及溫濕度條件研究青枯病的發(fā)病條件，結(jié)果表明當(dāng)土壤中Rs的濃度達(dá)到10

3、7 cfu g-1soil以上土壤溫度達(dá)到30℃，濕度維持在75％以上時(shí)煙株最易發(fā)病。
　　 從健康煙株根際土壤分離、篩選得到兩株高效的拮抗菌L-9和L-25，經(jīng)16S rRNA基因序列和生理生化分析，分別將兩株拮抗菌鑒定為Brevibacillus brevis（短短芽孢桿菌）和Streptomyces rochei（婁徹氏鏈霉菌）。平板拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這兩株拮抗菌不僅對(duì)茄科勞爾氏菌有較強(qiáng)的拮抗作用，平板拮抗圈分別達(dá)到11和

4、15 mm，而且對(duì)番茄青枯病、茄子青枯病、辣椒青枯病及煙草黑脛病等多種病害病原菌也有較好的平板拮抗作用。
　　 利用BIOLOG表型芯片鑒定系統(tǒng)對(duì)拮抗菌的特征性碳、氮源進(jìn)行分析，比較了兩種拮抗菌的平均顏色變化率（AWCD）和三種固體有機(jī)廢棄物菜粕有機(jī)肥、小麥麩、燕麥麩主要成分的利用情況。研究結(jié)果表明，L-9和L-25在菜粕有機(jī)肥中的9種主要氨基酸的AWCD值都分別大于在小麥麩和燕麥麩主要氨基酸的AWCD值。綜合其他的因素，確定菜

5、粕有機(jī)肥與牛糞1∶1(w∶w)的混合物為兩個(gè)拮抗菌二次發(fā)酵的最佳有機(jī)載體。
　　 通過拮抗菌發(fā)酵液和拮抗青枯病生物有機(jī)肥(BOF)的盆栽和大田試驗(yàn)，研究了兩株拮抗菌的拮抗效果。結(jié)果表明，L-9生物有機(jī)肥與L-25生物有機(jī)肥1∶1(w∶w)處理在盆栽試驗(yàn)的各處理中防控效果最好，其防控率高達(dá)100％，大田試驗(yàn)的防治效果分別達(dá)到了95.4％（安徽試驗(yàn)大田）和30.1％（貴州試驗(yàn)大田）。BOF處理防控效果顯著好于拮抗菌發(fā)酵液處理;L-9

6、生物有機(jī)肥與L-25生物有機(jī)肥1∶1配比施入土壤，要比單菌生物有機(jī)肥處理防控效果更好，發(fā)病率和病情指數(shù)最低，煙株生物量最大，根際土壤中病原菌數(shù)量最少，濃度控制在不易發(fā)病的106 cfu g-1 soil以下。
　　 BOF處理根際的細(xì)菌和放線菌數(shù)量也顯著高于病土處理，而真菌和病原菌的數(shù)量卻顯著低于病土處理;BOF處理的煙草的各種抗性酶活性如POD、CAT、PPO、SOD等與病土處理有顯著差異，土壤各種酶活性與病土處理也有顯著差異

7、;掃描電鏡結(jié)果顯示，發(fā)病煙株的維管束導(dǎo)管中有大量粘性物質(zhì)堵塞于其中，而且維管束嚴(yán)重變形，而健康煙株和施用BOF后未發(fā)病煙株的維管束長勢(shì)正常，未有嚴(yán)重變形;利用梯度變性凝膠電脈(DGGE)和BIOLOG-Ecoplate分析根際土壤的微生物變化，結(jié)果表明，施用BOF后微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，逐漸由“真菌型”向“細(xì)菌型”過渡;BOF處理的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)均高于病土處理;研究結(jié)果同時(shí)表明，施用BO

8、F不但可以抵制病害的發(fā)生，對(duì)煙葉產(chǎn)量也有較好的促進(jìn)作用，盆栽試驗(yàn)與田間試驗(yàn)BOF處理與病土對(duì)照相比分別增產(chǎn)3.43和3.27倍。
　　 拮抗菌的根際定殖試驗(yàn)結(jié)果表明，煙草種子用拮抗菌發(fā)酵液處理后，拮抗菌會(huì)沿根系生長并附著在根和根毛上;而接種病原菌后，病原菌無法侵染根系，被阻擋在拮抗菌形成的生物保護(hù)殼（膜）外。熒光標(biāo)記的病原菌跟蹤結(jié)果表明，拮抗菌優(yōu)先定殖于煙草根表利于抑制病原菌的定殖。通過高效液相色譜法(HPLC)，分離并鑒定了煙

9、草根系分泌物中的酚酸類物質(zhì)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草根系分泌物中檢測到0.25μgg-1root DW根干重的苯甲酸和1.15μg g-1root DW的苯丙酸。外源添加苯甲酸和苯丙酸后，兩種物質(zhì)都是低濃度促進(jìn)病原菌與拮抗菌的生長，高濃度抑制生長，而且兩種酚酸類物質(zhì)對(duì)病原菌促生濃度（苯甲酸為300 mg L-1，苯丙酸為600 mg L-1）大于對(duì)兩株拮抗菌（L-9和L-25）的促生濃度，說明煙草土傳病原菌更能有效地利用根系分泌物。