解淀粉芽孢桿菌T-5防控番茄土傳青枯病的效果及機理研究.pdf

1、番茄（Lycopersicon esculentum Mill）是世界上主要的果蔬之一，在人類飲食習慣中占有非常重要的地位，廣泛種植于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，在我國也有大面積種植。番茄青枯病是由茄科勞爾氏菌（Ralstonia.solanacearum）引起的一種毀滅性土傳細菌病害，嚴重制約著番茄產業(yè)的發(fā)展和經濟效益的提高。隨著保護地栽培方式在我國大面積推廣，連作番茄土傳青枯病發(fā)生更趨嚴重。番茄土傳青枯病的防治是一種世界性的難題，傳統(tǒng)的

2、化學防治措施通常會帶來環(huán)境、食品安全等問題。生物防控土傳病害具有高效、穩(wěn)定和環(huán)保等優(yōu)點而備受國內外研究者的關注，并在防治土傳病害中發(fā)揮著越來越重要的作用。目前，對于生物防控番茄土傳青枯病雖有報道，但僅局限于生防效果方面，對生防機理研究甚少。另外，可供商品化開發(fā)應用的生防產品也不多。本研究通過根際富集法從青枯病發(fā)病嚴重田塊中生長健康的番茄植株根際分離獲得兩株對番茄青枯菌具有高效拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amylolique

3、facien T-5和CM-2，在此基礎上，研制出拮抗番茄土傳青枯病的專用生物有機肥，并通過盆栽及室內試驗研究了其生防效果與機理。探討了生防菌株T-5抵御番茄青枯病病原菌QL-Rs1115的作用機制，主要包括拮抗菌與病原菌在番茄根際和根表的行為特征及與番茄根系分泌物之間的相互影響機制。所獲主要結果如下:
　　1.拮抗菌資源的收集是生物防控土傳病害的基礎工作。采用根際富集法從健康番茄根際土壤中初篩出11株具有較強定殖能力的芽孢桿菌，

4、再結合平板對峙法，篩選得到5株對青枯菌具有拮抗效果的菌株。其中，T-5和CM-2菌株對青枯菌的拮抗能力最強，并且在PDA平板上對多種病原真菌有強烈抑制效果，因此被選為候選研究菌株。室內檢測結果表明，菌株T-5和CM-2均能產生鐵載體、吲哚乙酸和氨，并具備解磷能力等促進植物生長的特征。經形態(tài)學、16S rDNA分子生物學和生理生化鑒定，確定T-5和CM-2都為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens，Genbank登錄號分別為

5、JQ217371和JQ217370。
　　2.通過盆栽試驗研究了拮抗菌及其制成的生物有機肥對番茄的促生作用和番茄土傳青枯病的生物防控效果。結果表明，拮抗菌T-5和CM-2都能顯著促進番茄生長并有效降低了番茄青枯病的病情指數(shù)。T-5和CM-2的不同接種方式能顯著影響其促生及生防效果，以番茄根部蘸菌和土壤接種拮抗菌的處理（PST-5和PScM-2）中，青枯病的病情指數(shù)最低，生防效果分別達到79.4％和70.1％;番茄植株生物量中干重、

6、鮮重、根總長、根面積、根體積等指標都高于其他處理;番茄根際中的拮抗菌數(shù)量維持在107CFUg-1干土以上，病原菌的數(shù)量分別只有1.38×106和2.75×106CFUg-1干土。其次是土壤接種拮抗菌的處理（ST-5和ScM-2），病情指數(shù)分別為34.17％和40.0％;番茄根際中的拮抗菌數(shù)量維持在106CFUg-1干土以上，病原菌數(shù)量分別只有5.13×106和5.89×106CFUg-1干土。對照處理中番茄青枯病的病情指數(shù)高達80.83

7、％，番茄根際中的病原菌數(shù)量高達2.34×108CFUg-1干土。由拮抗菌T-5和CM-2與有機肥固體二次發(fā)酵生產的生物有機肥（BIO5和BIO2）能顯著促進番茄生長及降低番茄青枯病的病情指數(shù)。其中BIO5和BIO2處理的番茄株高比對照處理分別增加42.1％和34.1％，地上部干重分別增加61.8％和34.7％。BIO5和BIO2能顯著降低番茄青枯病的病情指數(shù)，病情指數(shù)僅23.7％和34.2％，而對照處理的病情指數(shù)高達92.4％。施用生物

8、有機肥BIO5和BIO2能夠顯著降低番茄根際土中病原菌的數(shù)量，其數(shù)量分別只有1.23×106和2.24×106CFUg-1干土，對照番茄根際土中病原菌數(shù)量則達到了1.70×108CFUg-1干土。綜上所述，拮抗菌T-5和CM-2及其生物有機肥可以促進番茄生長，顯著降低了番茄土傳青枯病的病情指數(shù)，且拮抗菌能夠在番茄根際穩(wěn)定定殖，有效降低番茄根際土中病原菌的數(shù)量。
　　3.拮抗菌在植物根際成功定殖在生物防控土傳病害中起著關鍵性的作用。

9、分別構建了帶有綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因和紅色熒光蛋白(Red Fluorescent Protein，RFP)基因標記的菌株T-5（T-5-GFP）和QL-Rs1115（QL-RFP）菌株，研究了T-5-GFP與QL-RFP在番茄根際中的行為特征。結果表明，T-5-GFP和QL-RFP分別能發(fā)出強烈綠色和紅色熒光，質粒能在T-5和QL-Rs1115菌株中穩(wěn)定遺傳，無抗性條件下連續(xù)培養(yǎng)

10、120h，質粒穩(wěn)定性分別為88.4％和91.4％;且外源質粒的導入對T-5-GFP和QL-RFP的生物學特性不造成影響。T-5-GFP能夠在番茄根部穩(wěn)定定殖，維持一定的定殖數(shù)量，并且在番茄根表能形成生物膜，占據(jù)QL-RFP的侵染位點，成功抑制QL-RFP的數(shù)量增長。通過熒光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microcopy,CLSM)掃描觀察發(fā)現(xiàn)拮抗菌T-5-GFP的不同接種方式對其定殖特征及存活數(shù)量有很大

11、影響，其中根部蘸菌和土壤接種T-5-GFP的處理(PS5)中，T-5-GFP能夠在番茄根部穩(wěn)定定殖，并形成生物膜，定殖數(shù)量也維持在107CFUg-1干土以上;幾乎完全占據(jù)了QL-RFP的侵染位點，從而抑制了QL-RFP的增長速度。僅在根部蘸菌的處理(P5)，T-5-GFP在番茄根部未能形成生物膜，定殖數(shù)量只維持在105CFUg-1干土左右，不能完全阻止QL-RFP對番茄根部的侵染，QL-RFP數(shù)量增長速度也較快。
　　4.限菌條件

12、下收集番茄根系分泌物，發(fā)現(xiàn)拮抗菌T-5在番茄根系分泌物中能快速生長。菌株T-5對番茄根系分泌物有強烈的趨向性，且與番茄根系分泌的濃度呈正相關。營養(yǎng)豐富的根系分泌物對菌株T-5的生物膜形成沒有促進作用，并在一定程度上抑制菌株T-5的生物膜形成。通過高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）測定了番茄根系分泌物中的有機酸，并研究了不同有機酸對菌株T-5的趨化性、群游泳動性、生物膜形

13、成以及定殖能力方面的影響。結果表明，番茄根系分泌物中的有機酸主要以草酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸和富馬酸為主，蘋果酸和檸檬酸能夠顯著影響菌株T-5的趨化性及群游泳動性，研究的有機酸對菌株T-5的生物膜形成沒有影響。此外，在番茄根部添加一定量的不同有機酸能夠對菌株T-5定殖能力產生不同的影響，其中蘋果酸和檸檬酸能夠顯著促進菌株T-5在番茄根部的定殖。
　　5.拮抗菌T-5能夠取得較好的生防效果，不僅在于其強大的定殖能力，其同樣可能能夠

14、誘導植物抗性。通過對番茄植株中有關抗性酶類的活性以及調控抗性系統(tǒng)的通道基因變化情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)雙接種拮抗菌T-5和病原菌QL-Rs1115的處理中與植物抗性相關的苯丙氨酸酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)等酶活性能夠快速上升，負責調控茉莉酸（Jasmonic Acid,JA）、乙烯(Ethylene，ET)、水楊酸(Salicylic Acid，SA)信號傳導途徑的基因表達量也是逐步升高，并一直高于只添加病原菌的