熒光定量PCR方法在土傳煙草青枯病生防研究中的應(yīng)用.pdf

1、煙草青枯病是由茄科勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的細(xì)菌性土傳病害,是煙草生產(chǎn)上的毀滅性病害。由于常規(guī)防治方法存在種種弊端,根際細(xì)菌介導(dǎo)的生物防治正成為備受人們關(guān)注的一種有效方法。本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株拮抗效果較好的短短芽孢桿菌,經(jīng)二次發(fā)酵用于煙草青枯病的防治。并且運(yùn)用文獻(xiàn)報(bào)道的引物,建立起10種微生物的熒光定量PCR擴(kuò)增方法,為快速檢測(cè)根際微生物群落數(shù)量,探索病原菌和拮抗茵在煙草根際的互作效應(yīng),從而進(jìn)一步了解生

2、物有機(jī)肥對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響提供了可靠的方法.研究結(jié)果分述如下:
　　 (1)運(yùn)用文獻(xiàn)報(bào)道引物分別對(duì)細(xì)菌、真菌、固氮茵、勞爾氏菌以及硝化細(xì)菌等10種微生物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,優(yōu)化反應(yīng)條件,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。擴(kuò)增結(jié)果顯示建立的熒光定量PCR方法擴(kuò)增效率達(dá)到90％-105%(R2＞0.99),符合定量檢測(cè)要求,引物特異性好,引物濃度適宜,沒有引物二聚體干擾,退火溫度適宜。
　　 (2)分別采用傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法與熒光

3、定量PCR法對(duì)土壤中已知濃度的勞爾氏茵進(jìn)行檢測(cè),以驗(yàn)證熒光定量PCR方法的相對(duì)可靠性.試驗(yàn)結(jié)果表明,熒光定量PCR檢測(cè)速度快,操作簡單,檢測(cè)結(jié)果比平板計(jì)數(shù)結(jié)果更接近理論值,且三次試驗(yàn)的重復(fù)性比平板計(jì)數(shù)結(jié)果更好,說明熒光定量PCR法檢測(cè)土壤中微生物具有準(zhǔn)確率高、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),可用于土壤微生物的快速檢測(cè).
　　 (3)采用盆栽試驗(yàn)的方法,檢驗(yàn)生物有機(jī)肥對(duì)煙草青枯病的防治效果。試驗(yàn)結(jié)果表明,施用生物有機(jī)肥顯著降低了抗病品種K326

4、和感病品種南江三號(hào)煙草青枯病的發(fā)病率,且還促進(jìn)了煙草生長,生物量增加14%以上。
　　 (4)采用熒光定量PCR方法,研究了生物有機(jī)肥處理對(duì)盆栽煙草根際青枯病原菌及拮抗茵動(dòng)態(tài)變化的影響.結(jié)果表明:只接種病原茵處理(RS)土壤中青枯病原菌的fliC基因拷貝數(shù)顯著高于先接種病原茵再施用生物有機(jī)肥處理(RS+B10)和先施用生物有機(jī)肥后接種病原菌處理(BIO+RS)土壤中fliC基因拷貝數(shù),且這種效應(yīng)與生育期和品種無關(guān).旺盛生長期前,

5、施用生物有機(jī)肥處理土壤中短小芽孢桿菌屬拮抗菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)也顯著高于RS處理,說明生物有機(jī)肥將大量拮抗茵帶入土壤并在根周定殖。
　　 (5)2010年在福泉青枯病嚴(yán)重的連作田塊上進(jìn)行了"BIO"功能性微生物肥料的生防試驗(yàn)的研究。大田移栽前施用"BIO"功能性微生物肥料,移栽后不同時(shí)期調(diào)查煙草青枯病的病情指數(shù),以驗(yàn)證功能性肥料的生防效果。感病品種紅花大金元在收獲前發(fā)病率為100%,所有處理病情指數(shù)同對(duì)照相當(dāng),抗病品種