解淀粉芽孢桿菌SQRT3防控番茄土傳青枯病及其機(jī)理研究.pdf

1、番茄廣泛分布于世界各地，是重要的蔬菜作物之一。番茄青枯病是一種由茄科勞爾氏菌所引起的毀滅性土傳病害，廣泛分布于熱帶、亞熱帶以及部分溫帶地區(qū)，每年均造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約著番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。由于青枯菌生化變種多，其致病力、生化型和血清型等差異很大，而且寄主范圍廣，因此青枯菌的防控是一個(gè)世界性難題。傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥防治，不斷增強(qiáng)了病原菌的抗藥性，而且殘留農(nóng)藥污染環(huán)境，影響食品安全。生物防治因具有對環(huán)境友好、病原菌不容易產(chǎn)生抗性、對人畜安全

2、等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。本文研究了拮抗菌SQRT3對番茄土傳青枯病防控效果、在番茄根部的定殖情況和對番茄的誘導(dǎo)抗性等，以初步闡明其防控機(jī)理。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.拮抗菌SQRT3在NA培養(yǎng)基上對番茄青枯病病原菌Ralstonia solanacearumZJ3721有很強(qiáng)的拮抗效果，抑菌圈直徑為17-25 mm;而且對多種植物病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用。將菌株SQRT3發(fā)酵液通過RP-HPLC進(jìn)行組分分離收集，通過與青枯

3、菌R.solanacearum對峙試驗(yàn)和質(zhì)譜分析圖推斷，分子量為104.3的小分子能夠抑制青枯菌生長，該物質(zhì)未見報(bào)道。通過形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA基因的分子生物學(xué)鑒定，確定拮抗菌SQRT3為解淀粉芽孢桿菌;拮抗菌SQRT3具有形成生物膜、分泌蛋白酶、植酸酶和鐵載體及溶解難溶性無機(jī)磷的能力，能夠分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨;拮抗菌株SQRT3生長的最適溫度為30-35℃，pH為7.0，NaCl濃度為1.5％，最佳碳源為蔗糖，氮源為牛肉膏。<

4、br>　　2.拮抗菌和有機(jī)肥配施能夠顯著提高拮抗菌SQRT3在土壤的存活率，在42天內(nèi)數(shù)量穩(wěn)定在107 CFU·g-1干土以上，而不添加有機(jī)肥的處理在接種初期拮抗菌SQRT3數(shù)量下降很快。腐熟的有機(jī)肥中添加不同比例的生豬糞對番茄根際土中拮抗菌SQRT3數(shù)量、芽孢數(shù)量、番茄生物量影響不大。
　　用不同方式接種拮抗菌SQRT3都可以顯著減少番茄根際青枯菌的數(shù)量，延緩了番茄土傳青枯病的發(fā)生，降低了發(fā)病率;而番茄在含5％淀粉的菌懸液中蘸根

5、處理比在PBS菌懸液中灌根處理防控青枯病的效果更佳，兩種處理的生防率分別為81.25％和65.84％。番茄苗在舍5％淀粉菌懸液中的蘸根處理在不同時(shí)期其拮抗菌數(shù)量均超過了PBS菌懸液灌根處理的拮抗菌數(shù)量，而其青枯菌的數(shù)量明顯低于PBS菌懸液灌根處理的。
　　試驗(yàn)表明SQRT3對番茄的生長具有明顯的促生作用，植株的鮮重、干重、莖粗、根總長、根體積、根面積以及葉綠素含量都顯著高于對照。其中株高和植株地上部分干重分別是CK的1.32倍和1

6、.47倍。HPLC分析結(jié)果表明，拮抗菌SQRT3能產(chǎn)生植物生長促生物質(zhì)包括吲哚-3-乙酸、赤霉素和吲哚丁酸等。
　　3.拮抗菌SQRT3具有植酸酶活性。拮抗菌SQRT3發(fā)酵液的植酸酶活性受發(fā)酵溫度影響較大，37℃為植酸酶活性最適發(fā)酵溫度，且在第48小時(shí)達(dá)到最大活性16.33 UmL-1，生長量為OD600=1.96;發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，在第72小時(shí)達(dá)到最大活性11.18U mL-1，生長量為OD600=3.16;植酸酶能夠在較廣的

7、pH(pH3.5-8.5)范圍內(nèi)降解植酸，其最適降解條件為37℃和pH5.5;從拮抗菌SQRT3基因組DNA中擴(kuò)增出1152bp的植酸酶(Phytase)基因，編碼383個(gè)氨基酸，該基因的氨基酸序列與B.amyloliquefaciens subsp.Plantarum CAU B946的3-phytase基因的氨基酸序列具有100％的同源性。該P(yáng)hytase蛋白序列第26位和第27位存在信號肽切割位點(diǎn)(26A-K27)，成熟蛋白由35

8、7個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為39.24 kDa，等電點(diǎn)pI=4.74。將植酸酶基因克隆到pET28a(+)載體上，轉(zhuǎn)入E.coli BL21中表達(dá)，并對其進(jìn)行純化，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE分析，可見目的蛋白約為40 kDa。
　　4.通過PEB法成功將GFP標(biāo)記質(zhì)粒pHapⅡ轉(zhuǎn)入拮抗菌SQRT3內(nèi)，得到能夠表達(dá)GFP的標(biāo)記菌株SQRT3-GFP;和野生菌相比，標(biāo)記菌株的生長速度、拮抗能力、成膜能力沒有下降或者沒有明顯下

9、降。純培養(yǎng)條件下，標(biāo)記菌株中的質(zhì)粒pHapⅡ在無選擇壓力下在短期內(nèi)保持穩(wěn)定，培養(yǎng)到第120小時(shí)，質(zhì)粒丟失率為14.2％;在土壤環(huán)境中，接種SQRT3-GFP25天后，其pHapⅡ的丟失率為33.7％。標(biāo)記菌株懸浮在5％淀粉溶液（處理GS）中后，再通過蘸根方式接種15天后，番茄根表的SQRT3-GFP數(shù)量超過了107 CFU·g-1根;而標(biāo)記菌株懸浮在磷酸緩沖液(PBS)中（處理G），再通過蘸根方式接種，15天后番茄根表的SQRT3-GF

10、P數(shù)量低于106 CFU·g-1根，這表明淀粉菌懸液蘸根法使得拮抗菌SQRT3定殖效果更好;SQRT3-GFP主要定殖在番茄的伸長區(qū)和成熟區(qū)，根尖沒有檢測到熒光標(biāo)記的菌株。
　　5.經(jīng)拮抗菌SQRT3誘導(dǎo)處理的番茄苗在接種R.solanacearum ZJ3721后，葉片中PPO和POD抗性酶的活性快速上升，顯著高于未誘導(dǎo)的處理;拮抗菌SQRT3處理能夠降低番茄葉片膜脂過氧化程度;拮抗菌SQRT3誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生系統(tǒng)抗性主要依靠JA信