Bacillus amyloliquefaciens B3生防促生相關(guān)基因和內(nèi)生質(zhì)粒pBSG3的研究及高效生防工程菌的構(gòu)建.pdf

1、芽孢桿菌好氧或兼性厭氧，產(chǎn)芽孢，廣泛存在于自然界中，由于其生長速度快，次生代謝產(chǎn)物豐富，利用價值高以及對人畜安全等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)中．本實驗室早年篩選并開發(fā)了芽孢桿菌生防制劑“麥豐寧”，該茵劑的有效成分為芽孢桿菌B3．本研究應(yīng)用多相分類方法、消減抑制雜交技術(shù)、全基因組測序技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)對芽孢桿菌B3進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，主要內(nèi)容包括，1）確定B3菌株的分類地位；2）揭示B3的生防促生機理；3）B3菌株內(nèi)生隱蔽質(zhì)粒的研究；4

2、）Harpin蛋白和生防芽孢桿菌相結(jié)合的高效生防工程菌的研發(fā)．主要研究結(jié)果如下：
　　 1．多相分類體系，即將形態(tài)、生理生化、脂肪酸分析、分子鑒定等方法相結(jié)合，對細(xì)菌進(jìn)行較準(zhǔn)確的鑒定，本研究著重采用分子生物學(xué)手段將早期實驗室分離和經(jīng)表型鑒定的生防芽孢桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確分類。11株生防芽孢桿菌首先進(jìn)行脂肪酸甲酯（fattyacid methyl ester, FAME）鑒定，接著進(jìn)行16S rDNA和gyrB基因序列擴增和分析鑒定，同時

3、進(jìn)行基因組BOX-PCR指紋圖譜分析鑒定，綜合脂肪酸甲脂鑒定和一系列分子鑒定結(jié)果，將11株生防芽孢桿菌鑒定為：短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)1株，蠟樣芽孢桿菌組群（Bacillus cereus）2株，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）4株，萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）1株，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）3株，“麥豐寧”有效成分芽孢桿菌B

4、3最終被鑒定為解淀粉芽孢桿菌．此外，通過基質(zhì)協(xié)助激光解吸附/電離-飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time offlight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)這11株生防菌都能夠產(chǎn)生一種或多種抑制真菌的脂肽化合物(如Fengycin和Bacillomycin D)或抑制細(xì)菌的聚酮類化合物（如Difficidin，Bacil

5、laene等）．
　　 2．我們應(yīng)用差減雜交技術(shù)、全基因組測序技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)以揭示解淀粉芽孢桿菌B3生防和促生的機理。將解淀粉芽孢桿菌B3與不具生防能力的芽孢桿菌模式菌株枯草芽孢桿菌168進(jìn)行差減雜交，共得到了49個B3特異片段，其中包含了在生防芽孢桿菌中起主要作用的非核糖體肽類抗生素合成酶編碼基因片段，同時我們也發(fā)現(xiàn)了新的非核糖體合成酶編碼基因和一個內(nèi)生質(zhì)粒。我們在德國比勒菲爾德大學(xué)進(jìn)行了B3全基因組測序，在此平臺上，我們將新

6、發(fā)現(xiàn)的非核糖體合成酶基因簇進(jìn)行了分析和預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其包括7個模塊，其中有兩個是負(fù)責(zé)半胱氨酸的縮合，一個是天冬氨酸或酰胺的縮合，另外四個模塊沒有預(yù)測出結(jié)果，此外，我們對B3基因組中所有的非核糖體肽類抗生素的合成酶和促生相關(guān)基因進(jìn)行了分析．結(jié)果顯示，B3中含有8個非核糖體肽合成酶基因簇、1個二肽類抗生素編碼基因簇，還有參與生物膜形成和定殖相關(guān)基因簇（EPS，PGA operon），以及能夠促進(jìn)植物生長的吲哚乙酸合成關(guān)鍵基因和2，3-丁二醇合成

7、相關(guān)基因等。
　　 3．具有良好拮抗和促生作用的Bacillus amyloliquefaciens B3舍有一個可以自我復(fù)制的內(nèi)生隱蔽性質(zhì)粒pBSG3。對該質(zhì)粒完全測序，結(jié)果顯示，其大小為8439bp，GC含量40.3％．序列分析和比對顯示，pBS03中含有7個可預(yù)測的開放閱讀框（ORF），分別是repB3，mobB3，rapQ，phrQ, pgsR和兩個未知ORFs（Drflc和orf2）．通過Southem雜交和復(fù)制元件的

8、序列分析，最終確定pBSG3采取滾環(huán)式復(fù)制方式(Rolling-circle mechanism)進(jìn)行復(fù)制，屬于滾環(huán)式復(fù)制質(zhì)粒家族?；騧obB3的存在預(yù)示質(zhì)粒pBSG3具有在芽孢桿菌群體中可以轉(zhuǎn)移的特性．我們對質(zhì)粒中的RapQ-PhrQ系統(tǒng)進(jìn)行了初步的功能研究，該系統(tǒng)參與了芽孢桿菌的孢子形成的過程，RapQ蛋白能夠推遲孢子的形成。此外，我們將pBSG3的部分或全部復(fù)制單元克隆到pMD18-T載體，成功開發(fā)了穿梭載體pTRD和pTRDS

9、，并進(jìn)行了兩個質(zhì)粒的穩(wěn)定性測定，結(jié)果顯示，pTRDS的結(jié)構(gòu)和分離穩(wěn)定性都非常好。隨后，我們將本實驗室的Harpin蛋白編碼基因hpal克隆到質(zhì)粒pTRDS，并轉(zhuǎn)入了芽孢桿菌OKB105中，利用RT-PCR的方法在RNA水平檢測到了hpal的轉(zhuǎn)錄。綜上所述，內(nèi)生質(zhì)粒pBSG3不但可能是芽孢桿菌種群中遺傳物質(zhì)的交換工具，而且可以被用來開發(fā)和利用成為芽孢桿菌研究的克隆、表達(dá)載體．
　　 4．本著將具有促生防病效果的Harpin蛋白和產(chǎn)

10、非核糖體肽類抗生素的生防芽孢桿菌相結(jié)合的原則，將HpaGxooC編碼基因hpal與可產(chǎn)生多種脂肽類和聚酮類化合物的根圍促生拮抗解淀粉芽孢桿菌FZB42相結(jié)合，創(chuàng)制更具有價值的生防制劑．在本研究中，我們構(gòu)建了pGAprEHS、pUNprEKHS兩個重組表達(dá)載體，并將它們轉(zhuǎn)化到解淀粉芽孢桿菌FZB42中，利用雙交換同源重組技術(shù)，將hpal分別整合到FZB42的蛋白水解酶編碼基因aprE和nprE位點．這兩個重組載體都含有P43強啟動子和np

11、rB信號肽組件，這有助于Harpin蛋白的連續(xù)表達(dá)和向外分泌。經(jīng)過PCR驗證和RT-PCR的分析，結(jié)果顯示：成功構(gòu)建了雙拷貝Harpin外泌工程菌株FZBHaxpin，且hpal能在RNA水平上正常轉(zhuǎn)錄。隨后，我們對野生菌FZB42，工程菌FZBHarpin和雙突變菌株FZBAN分別進(jìn)行了溫室和大田實驗，評估了其促生和防治水稻白葉枯病的效果，實驗數(shù)據(jù)表明FZBHarpin具有比其出發(fā)菌株FZB42更好的促生和生防效果；同時，我們觀察到a