半夏內(nèi)生菌Pseudomonas aeruginosa pY11T-3-1生防效果及活性成分分析.pdf

1、半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)是天南星科的一種重要的傳統(tǒng)藥用植物。生物防治是預(yù)防半夏等中藥材病害的首選方法。本論文針對(duì)栽培半夏中發(fā)病較高的軟腐病,對(duì)前期所分離的半夏高效內(nèi)生菌——銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)pY11T-3-1進(jìn)行初步應(yīng)用研究,并探索活性成分的分離純化及初步鑒定方法。
　　 首先,對(duì)生防菌P.Aeruginosa pY11T-3.1進(jìn)行了植株軟腐

2、病防治、促生長和室內(nèi)安全生測等試驗(yàn)。結(jié)果,生防菌P.aeruginosa pY11T-3-1可在半夏、番茄、白菜等植物中穩(wěn)定定殖,并有效抑制這些植物的軟腐病發(fā)生,生防效果在80％以上。促生長試驗(yàn)表明生防菌P.aeruginosa pY11T-3-1對(duì)3種植物的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、株高、鮮重及日增長量具有一定的促進(jìn)作用。室內(nèi)安全性生測結(jié)果表明,高濃度生防菌P.aeruginosa pY11T-3-1抑制植物生長,中低濃度則促進(jìn)植物生長。可見,

3、適宜濃度的生防菌對(duì)植物不僅安全無害,而且還具有一定的促進(jìn)作用,在實(shí)際生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用潛力。
　　 其次,初步優(yōu)化了生防菌P.aeruginosa pY11T-3-1活性成分產(chǎn)生的最佳條件。單因子發(fā)酵條件試驗(yàn)表明,生防菌發(fā)酵產(chǎn)生活性成分的最佳條件為:140ml裝液量、pH7.0發(fā)酵液、10％接種量、30℃培養(yǎng)24-48h。按照此條件,成功地在發(fā)酵罐培養(yǎng)了P.aeruginosapY11T-3-1。耐受性檢測表明,該菌的生防活性

4、成分對(duì)高溫、堿性環(huán)境的耐受性較強(qiáng),冷凍干燥和真空干燥對(duì)其活性影響較小。因此,可采用冷凍干燥對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行干燥濃縮。
　　 最后,探索了生防菌的分離、純化及鑒定方法。膜與理化分離結(jié)果表明,PW4040F型超濾陶瓷膜可有效地對(duì)生防菌P.aeruginosa pY11T-3-1發(fā)酵液中的活性成分進(jìn)行分離,其對(duì)發(fā)酵液中雜質(zhì)截留量及膜清洗后通量恢復(fù)率分別為89.5％、92.9％;DK4040F型納濾膜對(duì)超濾液中的活性成分的效價(jià)進(jìn)一步濃縮,濃

5、縮倍數(shù)為,濃縮液的含固率為1.81％;乙酸乙酯則可對(duì)該菌的活性成分進(jìn)行高效萃取。可見,膜分離和溶劑萃取菌可用于活性成分的初步分離,膜分離適用于大量制備,乙酸乙酯萃取適用于小規(guī)模操作。
　　 對(duì)以上初步分離物進(jìn)行純化與初步鑒定。薄層層析結(jié)果表明,正己烷:乙酸乙酯(85:15)的分離效果最佳,分離條帶為3-5條。用此溶劑系統(tǒng),對(duì)粗提物ASW進(jìn)行硅膠柱分離,獲得具有抑菌活性的分離物ASW20-30,其中分離物ASW20的抑菌活性最強(qiáng)。

6、高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn),用甲醇:水(=70:30)作流動(dòng)相,分離物ASW20可以進(jìn)行較好地分離,獲得2個(gè)主峰,峰面積分別為42.2％、36.71％;質(zhì)譜鑒定,相應(yīng)地得到2個(gè)主峰ASN206和ASN207,其保留時(shí)間分別為46.20 min、6.77 min,相對(duì)分子量分別為259、271,結(jié)合文獻(xiàn)初步確定分離物ASN206和ASN207分別為吡咯特林(pyoluteorin)和吡咯尼群(pyrronitrin)。此外,尚可確定分子量的產(chǎn)物