利用Ⅱ型機(jī)制組成型分泌表達(dá)Harpin的生防工程菌的構(gòu)建.pdf

1、基因工程生防菌的應(yīng)用為植物病蟲害的綜合治理提供了一項(xiàng)具有廣闊前景的重要手段.該文將梨火疫歐文氏桿菌中,利用Ⅲ型機(jī)制分泌的植物抗性誘導(dǎo)蛋白Harpin克隆于誘導(dǎo)表達(dá)載體pExSecl的金黃色葡萄球菌蛋白A信號肽及ZZ片段的后面,通過Ⅱ型機(jī)制在大腸桿菌中表達(dá)和分泌ZZ::Harpin融合蛋白,為了使工程菌在植物表面能表達(dá)分泌Harpin,又將表達(dá)融合蛋白的基因克隆到組成型表達(dá)載體pKK233-2上,并轉(zhuǎn)化經(jīng)典的生防菌成團(tuán)泛菌308R,觀察了

2、重組生防工程菌的分泌表達(dá)、過敏反應(yīng)活性以及遺傳穩(wěn)定性問題.首先,根據(jù)GenBank中登錄的hrpN序列設(shè)計(jì)引物,以攜帶著hrp基因簇的質(zhì)粒pCPP430為模板擴(kuò)增、克隆出植物抗性誘導(dǎo)蛋白Harpin的結(jié)構(gòu)基因hrpN,與pGEM-T載體連接得到重組質(zhì)粒pGEM-T-hrpN,酶切分離hrpN片段,克隆到利用Ⅱ型分泌機(jī)制分泌目的蛋白的誘導(dǎo)型表達(dá)型載體pExSecl上,得到重組質(zhì)粒pExSecl-hrpN,采用CaCl2化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿

3、菌BL21(DE3),通過IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng),制備CFEP和胞外無細(xì)胞培養(yǎng)上清液,觀察重組菌的分泌表達(dá)及過敏反應(yīng)活性.結(jié)果表明:利用Ⅲ型機(jī)制分泌的Harpin蛋白,其N端連接上信號肽和ZZ片段后,不僅在E.coliBL21(DE3)中能利用Ⅱ型機(jī)制表達(dá)分泌,而且在Harpin前加一段164個氨基酸的SZZ序列或ZZ::Harpi n融合蛋白依然有活性.其次,以pExSecl-hrpN為模板擴(kuò)增SZZ-hrpN基因,PCR產(chǎn)物克隆于pGEM

4、-T載體,得到重組質(zhì)粒pGEM-T-SZZ-hrpN,酶切分離SZZ-hrpN片段,克隆于組成型表達(dá)載體pKK233-2的trc啟動子之后,并由此獲得重組質(zhì)粒pKK233-2-SZZ-hrpN.最終采用電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入成團(tuán)泛菌308R.結(jié)果表明:重組生防工程菌308R(pKK233-2-SZZ-hrpN)可組成型表達(dá)ZZ::Harpin融合蛋白,并能夠在信號肽序列的帶動下分泌到細(xì)胞外,且有過敏反應(yīng)活性.在構(gòu)建生防工程菌的過程中,重組質(zhì)粒的

5、遺傳穩(wěn)定性和工程菌在植物表面的定殖能力是影響生防效果的重要因素之一.我們將重組生防工程菌308R(pKK233-2-SZZ-hrpN)在無抗生素的LB培養(yǎng)基中連續(xù)傳代,檢測其質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性,并將工程菌噴灑于植物葉面,連續(xù)取樣檢測其定殖能力.結(jié)果表明:308R(pKK233-2-SZZ-hrpN)的質(zhì)粒穩(wěn)定性均比308R(pCPP430)略高,但是遠(yuǎn)低于帶有parDE序列的308R(pRTnp).因此,進(jìn)一步提高308R(pKK233-2