PLOD2反義寡核苷酸對(duì)TNBS誘導(dǎo)小鼠慢性腸纖維化的影響及療效觀察.pdf

1、研究背景:
　　炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)及克羅恩病(Crohn disease,CD),為腸道的慢性非特異性炎性疾病,其病因和發(fā)病機(jī)制尚不確切,近年來,其發(fā)病率持續(xù)增高,引起了人們高度的重視。長(zhǎng)期的慢性炎癥刺激能導(dǎo)致腸壁纖維化,且克羅恩病的病變累及范圍廣,為腸壁全層性炎癥,導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular

2、matrix,ECM)異常沉淀引起腸壁各解剖層發(fā)生纖維化,易產(chǎn)生瘢痕性狹窄從而導(dǎo)致腸梗阻。目前,對(duì)于慢性腸壁纖維化的治療,傳統(tǒng)的治療方法及外科手術(shù)治療效果均不理想,預(yù)后不佳,尚缺乏十分有效的治療手段。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),ECM的沉淀以膠原蛋白的沉積為主,賴氨酸羥化酶(lysyl hydroxylase,LH)在膠原蛋白的形成及穩(wěn)定中起著重要作用,其中尤以LH2作用最為關(guān)鍵,而PLOD(procollage-lysine,2-oxigluta

3、rate,5-dioxygerase)基因?yàn)長(zhǎng)H的編碼基因,因此,PLOD2有望成為預(yù)防或治療慢性腸纖維化的研究新方向。
　　目的:
　　前期研究表明,應(yīng)用三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)灌腸可成功誘導(dǎo)BALB/C小鼠慢性腸纖維化模型的建立,在此基礎(chǔ)上,我們合成PLOD2反義寡核苷酸,以此干預(yù)灌腸來探討PLOD2反義寡核苷酸對(duì)BALB/C小鼠慢性腸壁纖維化的影響及作用機(jī)制

4、。通過比較實(shí)驗(yàn)各組間小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI),觀察結(jié)腸組織的病理變化和膠原纖維的增生程度,比較分析TNF-α、PLOD2、Col-ⅢmRNA的表達(dá)水平及Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平,進(jìn)而分析PLOD2反義寡核苷酸在TNBS誘導(dǎo)小鼠慢性腸壁纖維化中的作用,探討其作用機(jī)制,并為PLOD2反義寡核苷酸治療慢性腸壁纖維化及開發(fā)相關(guān)基因治療藥物提供一定的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　隨機(jī)將40只體重為20-25g、6-8周齡的

5、雌性BALB/C小鼠分為4組,每組10只,分別為生理鹽水空白對(duì)照組(空白對(duì)照組),TNBS模型組(TNBS組),PLOD2錯(cuò)義寡核苷酸陰性對(duì)照組(MSODN組)及PLOD2反義寡核苷酸治療組(ASODN組)。對(duì)BALB/C小鼠采用灌腸的方式建立動(dòng)物模型,空白對(duì)照組每周給予生理鹽水100ul灌腸后24小時(shí)再次給予生理鹽水100ul灌腸;TNBS模型組每周先給予2mg TNBS/50％乙醇溶液100u1灌腸,24小時(shí)后給予生理鹽水100ul

6、灌腸;PLOD2錯(cuò)義寡核苷酸陰性對(duì)照組每周先給予2mg TNBS/50%乙醇溶液100u1灌腸,24小時(shí)后給予PLOD2錯(cuò)義寡核苷酸100ul灌腸;PLOD2反義寡核苷酸治療組每周先給予2mg TNBS/50%乙醇溶液100u1灌腸,24小時(shí)后給予PLOD2反義寡核苷酸100ul灌腸;每組均連續(xù)灌腸6周,于最后1次灌腸后1周采取頸椎脫臼法處死小鼠并取結(jié)腸組織。采集的結(jié)腸組織分別進(jìn)行如下處理:即HE染色評(píng)估結(jié)腸組織炎癥程度;VG染色評(píng)估結(jié)

7、腸組織纖維化程度;RT-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中TNF-α、PLOD2、COL-III的mRNA的表達(dá);免疫組化檢測(cè)結(jié)腸組織中COL-III蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.TNBS組、MSODN組及ASODN組小鼠每次灌腸后出現(xiàn)不同程度的癥狀,如少食,少動(dòng),身體蜷縮,稀便,大便潛血陽性甚至肉眼血便,皮毛光澤度下降等,第3-4天后上述癥狀逐漸減輕。小鼠的體重大部分在第2-4天有不同程度的下降,部分第4天后體重較前有所增加,甚

8、至超過灌腸前體重。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,癥狀以前3周最重,第4周后癥狀相對(duì)減輕。三組小鼠均有個(gè)別小鼠死亡,死亡時(shí)間主要在前3周?？瞻讓?duì)照組灌腸后進(jìn)食及活動(dòng)情況無明顯改變,無小鼠死亡。TNBS組、MSODN組及ASODN組小鼠DAI評(píng)分均高于空白對(duì)照組(P<0.05);TNBS組、MSODN組及ASODN組組間相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2.肉眼觀察各組小鼠結(jié)腸組織的大體表現(xiàn),可見TNBS組、MSODN組及ASODN組有不同程

9、度的充血、水腫、粘連等,剖開后腸壁有不同程度的糜爛、潰瘍,有的部位出現(xiàn)管壁增厚、狹窄、僵硬變形等表現(xiàn),空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織則無上述改變。HE染色鏡下觀察空白組小鼠結(jié)腸組織無明顯炎癥表現(xiàn), TNBS組、MSODN組及ASODN組都可見不同程度的上皮細(xì)胞、腺體及隱窩的破壞,杯狀細(xì)胞減少,以淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞為主的炎癥浸潤(rùn),可有淋巴濾泡增生,部分結(jié)腸組織可出現(xiàn)粘膜層潰瘍,部分甚至達(dá)粘膜肌層。TNBS組、MSODN組及ASODN組小鼠炎癥評(píng)分

10、均高于空白對(duì)照組(P<0.05);而這三組間相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。VG染色鏡下可見空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織無明顯纖維化表現(xiàn),而TNBS組及MSODN組中小鼠結(jié)腸組織中可見大量膠原蛋白沉積,固有肌層可有不同程度的增厚,部分甚至可見纖維分隔。ASODN組中小鼠結(jié)腸組織的膠原蛋白沉積及固有肌層增厚程度較TNBS組及MSODN組輕。TNBS組、MSODN組及ASODN組小鼠纖維化評(píng)分均高于空白對(duì)照組(P<0.05);TNBS組及MS

11、ODN組組間相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而ASODN組評(píng)分低于TNBS組及MSODN組(P<0.05)。
　　3.TNBS組、MSODN組中PLOD2mRNA的表達(dá)高于空白對(duì)照組及ASODN組(P<0.05),ASODN組高于空白組(P<0.05),TNBS組及MSODN組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)于TNF-αmRNA及Col-IIImRNA的表達(dá),TNBS組、MSODN組及ASODN組的表達(dá)均高于空白對(duì)照組(

12、P<0.05),但這三組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　4.TNBS組、MSODN組及ASODN組Col-III蛋白的表達(dá)較空白對(duì)照組高(P<0.05),但ASODN組比TNBS組、MSODN組表達(dá)低(P<0.05),而TNBS組及MSODN組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　應(yīng)用PLOD2 ASODN治療TNBS/50%EtOH誘導(dǎo)的小鼠慢性腸纖維化,其通過抑制PLOD2的表達(dá),降低LH