PLOD2反義寡核苷酸對TNBS誘導小鼠慢性腸纖維化的影響及療效觀察.pdf

1、研究背景:
　　炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)及克羅恩病(Crohn disease,CD),為腸道的慢性非特異性炎性疾病,其病因和發(fā)病機制尚不確切,近年來,其發(fā)病率持續(xù)增高,引起了人們高度的重視。長期的慢性炎癥刺激能導致腸壁纖維化,且克羅恩病的病變累及范圍廣,為腸壁全層性炎癥,導致大量細胞外基質(extracellular

2、matrix,ECM)異常沉淀引起腸壁各解剖層發(fā)生纖維化,易產(chǎn)生瘢痕性狹窄從而導致腸梗阻。目前,對于慢性腸壁纖維化的治療,傳統(tǒng)的治療方法及外科手術治療效果均不理想,預后不佳,尚缺乏十分有效的治療手段。國內外研究發(fā)現(xiàn),ECM的沉淀以膠原蛋白的沉積為主,賴氨酸羥化酶(lysyl hydroxylase,LH)在膠原蛋白的形成及穩(wěn)定中起著重要作用,其中尤以LH2作用最為關鍵,而PLOD(procollage-lysine,2-oxigluta

3、rate,5-dioxygerase)基因為LH的編碼基因,因此,PLOD2有望成為預防或治療慢性腸纖維化的研究新方向。
　　目的:
　　前期研究表明,應用三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)灌腸可成功誘導BALB/C小鼠慢性腸纖維化模型的建立,在此基礎上,我們合成PLOD2反義寡核苷酸,以此干預灌腸來探討PLOD2反義寡核苷酸對BALB/C小鼠慢性腸壁纖維化的影響及作用機制

4、。通過比較實驗各組間小鼠的疾病活動指數(shù)(DAI),觀察結腸組織的病理變化和膠原纖維的增生程度,比較分析TNF-α、PLOD2、Col-ⅢmRNA的表達水平及Col-Ⅲ蛋白的表達水平,進而分析PLOD2反義寡核苷酸在TNBS誘導小鼠慢性腸壁纖維化中的作用,探討其作用機制,并為PLOD2反義寡核苷酸治療慢性腸壁纖維化及開發(fā)相關基因治療藥物提供一定的實驗及理論依據(jù)。
　　實驗方法:
　　隨機將40只體重為20-25g、6-8周齡的

5、雌性BALB/C小鼠分為4組,每組10只,分別為生理鹽水空白對照組(空白對照組),TNBS模型組(TNBS組),PLOD2錯義寡核苷酸陰性對照組(MSODN組)及PLOD2反義寡核苷酸治療組(ASODN組)。對BALB/C小鼠采用灌腸的方式建立動物模型,空白對照組每周給予生理鹽水100ul灌腸后24小時再次給予生理鹽水100ul灌腸;TNBS模型組每周先給予2mg TNBS/50％乙醇溶液100u1灌腸,24小時后給予生理鹽水100ul

6、灌腸;PLOD2錯義寡核苷酸陰性對照組每周先給予2mg TNBS/50%乙醇溶液100u1灌腸,24小時后給予PLOD2錯義寡核苷酸100ul灌腸;PLOD2反義寡核苷酸治療組每周先給予2mg TNBS/50%乙醇溶液100u1灌腸,24小時后給予PLOD2反義寡核苷酸100ul灌腸;每組均連續(xù)灌腸6周,于最后1次灌腸后1周采取頸椎脫臼法處死小鼠并取結腸組織。采集的結腸組織分別進行如下處理:即HE染色評估結腸組織炎癥程度;VG染色評估結

7、腸組織纖維化程度;RT-PCR檢測結腸組織中TNF-α、PLOD2、COL-III的mRNA的表達;免疫組化檢測結腸組織中COL-III蛋白的表達水平。
　　結果:
　　1.TNBS組、MSODN組及ASODN組小鼠每次灌腸后出現(xiàn)不同程度的癥狀,如少食,少動,身體蜷縮,稀便,大便潛血陽性甚至肉眼血便,皮毛光澤度下降等,第3-4天后上述癥狀逐漸減輕。小鼠的體重大部分在第2-4天有不同程度的下降,部分第4天后體重較前有所增加,甚

8、至超過灌腸前體重。整個實驗期間,癥狀以前3周最重,第4周后癥狀相對減輕。三組小鼠均有個別小鼠死亡,死亡時間主要在前3周?？瞻讓φ战M灌腸后進食及活動情況無明顯改變,無小鼠死亡。TNBS組、MSODN組及ASODN組小鼠DAI評分均高于空白對照組(P<0.05);TNBS組、MSODN組及ASODN組組間相比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　2.肉眼觀察各組小鼠結腸組織的大體表現(xiàn),可見TNBS組、MSODN組及ASODN組有不同程

9、度的充血、水腫、粘連等,剖開后腸壁有不同程度的糜爛、潰瘍,有的部位出現(xiàn)管壁增厚、狹窄、僵硬變形等表現(xiàn),空白對照組小鼠結腸組織則無上述改變。HE染色鏡下觀察空白組小鼠結腸組織無明顯炎癥表現(xiàn), TNBS組、MSODN組及ASODN組都可見不同程度的上皮細胞、腺體及隱窩的破壞,杯狀細胞減少,以淋巴細胞及單核細胞為主的炎癥浸潤,可有淋巴濾泡增生,部分結腸組織可出現(xiàn)粘膜層潰瘍,部分甚至達粘膜肌層。TNBS組、MSODN組及ASODN組小鼠炎癥評分

10、均高于空白對照組(P<0.05);而這三組間相比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。VG染色鏡下可見空白對照組小鼠結腸組織無明顯纖維化表現(xiàn),而TNBS組及MSODN組中小鼠結腸組織中可見大量膠原蛋白沉積,固有肌層可有不同程度的增厚,部分甚至可見纖維分隔。ASODN組中小鼠結腸組織的膠原蛋白沉積及固有肌層增厚程度較TNBS組及MSODN組輕。TNBS組、MSODN組及ASODN組小鼠纖維化評分均高于空白對照組(P<0.05);TNBS組及MS

11、ODN組組間相比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05);而ASODN組評分低于TNBS組及MSODN組(P<0.05)。
　　3.TNBS組、MSODN組中PLOD2mRNA的表達高于空白對照組及ASODN組(P<0.05),ASODN組高于空白組(P<0.05),TNBS組及MSODN組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對于TNF-αmRNA及Col-IIImRNA的表達,TNBS組、MSODN組及ASODN組的表達均高于空白對照組(

12、P<0.05),但這三組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　4.TNBS組、MSODN組及ASODN組Col-III蛋白的表達較空白對照組高(P<0.05),但ASODN組比TNBS組、MSODN組表達低(P<0.05),而TNBS組及MSODN組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論:
　　應用PLOD2 ASODN治療TNBS/50%EtOH誘導的小鼠慢性腸纖維化,其通過抑制PLOD2的表達,降低LH