慢病毒介導(dǎo)α-反義寡核苷酸對(duì)β-地中海貧血小鼠的作用.pdf

1、背景：針對(duì)β-地中海貧血的α珠蛋白鏈相對(duì)過(guò)剩這一主要病理基礎(chǔ)，有研究報(bào)道應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)調(diào)控人α-珠蛋白基因表達(dá)，結(jié)果顯示α-反義寡核苷酸能有效地抑制體外培養(yǎng)的重型β-地中海貧血紅系細(xì)胞α-珠蛋白基因表達(dá)，改善珠蛋白基因α/β+γ的比例失衡。然而，對(duì)于人α-反義寡核苷酸治療β-地中海貧血的體內(nèi)試驗(yàn)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的：建立人源化水平較高的人源非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠模型，在此基礎(chǔ)上建立人

2、源β-地中海貧血小鼠模型，并構(gòu)建介導(dǎo)人α-反義寡核苷酸的慢病毒載體，探討慢病毒載體介導(dǎo)α-反義寡核苷酸對(duì)人源β-地中海貧血小鼠模型的作用。
　　 方法：1、將人正常骨髓或臍血單個(gè)核細(xì)胞分別移植給經(jīng)不同方案和劑量預(yù)處理的NOD/SCID小鼠，移植后小鼠腹腔注射重組人細(xì)胞因子。觀察小鼠存活情況，移植6周后檢測(cè)小鼠骨髓及外周血人-CD45+細(xì)胞比例。
　　 2、將β-地中海貧血患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)尾靜脈輸注給經(jīng)全身照射預(yù)處

3、理的NOD/SCID小鼠，移植后小鼠腹腔注射重組人細(xì)胞因子。觀察小鼠體重等一般狀況，移植5周后取小鼠骨髓及外周血，檢測(cè)人CD45+細(xì)胞比例，并行血紅蛋白電泳、珠蛋白肽鏈聚丙烯酰胺凝膠電泳、人β-地貧基因分析及透射電鏡觀察小鼠外周血及骨髓紅系細(xì)胞內(nèi)α-珠蛋白鏈的沉積情況，取小鼠的肝臟和脾臟行大體、普通病理及鐵染色檢查。
　　 3、針對(duì)人α-反義寡核苷酸序列，通過(guò)雙限制性內(nèi)切酶消化和連接的方法構(gòu)建pGCSIL-vshRNA-GFP載

4、體質(zhì)粒，接著該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌E.coliDH5α，通過(guò)PCR及基因測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，再經(jīng)Lipofectamine2000將pGCSIL-vshRNA-GFP，pHelper1.0和pHelper2.0三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒，通過(guò)綠色熒光蛋白的表達(dá)測(cè)定收集的病毒滴度。此外，同樣方法制備隨機(jī)序列慢病毒載體并包裝純化。
　　 4、將介導(dǎo)α-反義寡核苷酸的慢病毒載體，感染β-地中海貧血患者骨髓CD34+細(xì)胞后，

5、再輸注給經(jīng)全身照射預(yù)處理的NOD/SCID小鼠，并以輸注未經(jīng)感染的β-地貧骨髓細(xì)胞、感染隨機(jī)序列慢病毒的β-地貧骨髓細(xì)胞、正常骨髓CD34+細(xì)胞及空白小鼠為對(duì)照。觀察小鼠體重等一般狀況，移植6周后，取小鼠骨髓及外周血，檢測(cè)人CD45+細(xì)胞比例，并行血紅蛋白電泳及人β-地貧基因分析，取小鼠的肝臟和脾臟行大體、普通病理及鐵染色檢查。
　　 結(jié)果：1、全身照射(加或不加環(huán)磷酰胺)骨髓移植組和全身照射(加或不加環(huán)磷酰胺)臍血移植組小鼠輸

6、注人單個(gè)核細(xì)胞數(shù)分別為(0.6560±0.0089)×106和(4.0775±0.8450)×106。全身照射/環(huán)磷酰胺組死亡率均為100％，全身照射組死亡率均為33.3％，且全身照射劑量越大，死亡率越高。移植6周后，小鼠骨髓中人CD45+細(xì)胞的比例，全身照射臍血移植組13號(hào)和6號(hào)小鼠分別為59.61％和21.46％，而全身照射骨髓移植組2號(hào)和8號(hào)小鼠其比例均為0，空白對(duì)照組小鼠比例均為0。
　　 2、β-地中海貧血患者骨髓細(xì)胞

7、移植NOD/SCID小鼠5周后，檢測(cè)小鼠骨髓和外周血人CD45+細(xì)胞比例分別為：β-地貧/HbE骨髓移植組：7.21％、4.08％(+47天)，7.37％、6.03％(+61天)，β-地貧骨髓移植組：8.17％、3.43％(+36天)，16.82％、8.89％(+45天)。移植組小鼠血紅蛋白電泳可見(jiàn)HbA2條帶，肽鏈分析顯示α鏈的條帶要比β鏈的條帶濃和寬，β-地貧基因檢測(cè)結(jié)果與供者相符，部分紅系細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)電子致密物(過(guò)剩α-珠蛋白肽鏈)

8、沉積。移植組小鼠脾臟長(zhǎng)度與其體重的比值比空白對(duì)照組的大[(0.5762±0.0451)vs(0.3628±0.0340)mm/g,P=0.000]，肝脾出現(xiàn)較明顯的鐵沉積。
　　 3、重組質(zhì)粒的外源基因PCR鑒定正確，基因測(cè)序結(jié)果與所需要的α-ASON序列完全一致，濃縮后慢病毒滴度為5×109TU/ml。
　　 4、慢病毒所感染的β-地貧骨髓細(xì)胞移植NOD/SCID小鼠，移植后6周各組小鼠與移植前體重比較：正常骨髓移植組

9、和空白對(duì)照組體重增加或顯著增加，而其余小鼠體重減輕或不增加。移植后6周各移植組小鼠骨髓和外周血能檢測(cè)到人CD45+細(xì)胞(0.01-8.39％)，且輸注β-地中海貧血患者細(xì)胞(不論是否輸注慢病毒感染細(xì)胞)的小鼠可檢測(cè)到與供者相符的人β-地貧突變基因，輸注β-地貧患者細(xì)胞的小鼠脾臟長(zhǎng)度與其體重的比值比正常骨髓移植及空白對(duì)照組的大[(0.6848±0.0886)vs(0.5573±0.0088)mm/g，P=0.016]。在α-ASON-LV

10、感染β-地貧骨髓細(xì)胞移植組，肝脾(尤其脾)鐵沉積比β-地貧骨髓移植組和NC-GFP-LV感染β-地貧骨髓細(xì)胞移植組的程度輕。
　　 結(jié)論：在輸注造血干細(xì)胞數(shù)量達(dá)閾劑量的基礎(chǔ)上，盡可能提高預(yù)處理的強(qiáng)度，并使用人細(xì)胞因子可提高人源NOD/SCID小鼠模型的人源化水平。將β-地中海貧血患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植給NOD/SCID小鼠，可建立人源化β-地中海貧血小鼠模型。所構(gòu)建介導(dǎo)α-反義寡核苷酸的慢病毒載體感染人β-地貧骨髓細(xì)胞植入NOD