腫瘤Fas-FasL途徑免疫逃逸機(jī)制探討及反義基因治療對策的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、該研究分為4個部分.第一部分:首先利用免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)等方法對人大腸癌細(xì)胞系SW620、Lovo、Colo205和人白血病T淋巴細(xì)胞系Jurkat進(jìn)行Fas/FasL表達(dá)檢測,結(jié)果顯示SW620細(xì)胞FasL為高表達(dá)、Fas為低表達(dá),Lovo細(xì)胞Fas/FasL皆為低表達(dá),Colo205細(xì)胞Fas/FasL皆有中等表達(dá),Jurkat細(xì)胞Fas為高表達(dá)、FasL為低表達(dá);然后選用FasL為高表達(dá)的SW620細(xì)胞與Fas

2、為高表達(dá)的Jurkat細(xì)胞體外共同培養(yǎng),作為Fas/FasL功能檢測的模型,并以FasL為低表達(dá)的Lovo細(xì)胞作為對照,通過乳酸脫氫酶法檢測細(xì)胞毒殺傷效應(yīng),通過TUNEL法原位細(xì)胞凋亡檢測和Annexin V流式細(xì)胞術(shù)早期凋亡檢測了解細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果表明大腸癌細(xì)胞SW620能夠引起T淋巴細(xì)胞Jurkat的凋亡.第二部分:由含人FasL cDNA序列的質(zhì)粒采用全同源粘性末端連接法構(gòu)建重組的反義FasL真核表達(dá)載體pcDNA3.1-as-

3、hFasL質(zhì)粒,經(jīng)過酶切和測序鑒定構(gòu)建成功.第三部分:以脂質(zhì)體為介導(dǎo)用反義質(zhì)粒載體pcDNA3.1-as-hFasL和空質(zhì)粒載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染人大腸癌細(xì)胞SW620,經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞SW620(as-hFL)和SW620(pcDNA3.1).第四部分:利用免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR等方法檢測FasL表達(dá),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染反義質(zhì)粒的SW620(as-hFL)細(xì)胞在mRNA和蛋白水平的Fa

4、sL表達(dá)較未轉(zhuǎn)染對照和空載體對照皆有明顯降低;對FasL功能的檢測通過乳酸脫氫酶法檢測細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)、TUNEL和Annexin V流式細(xì)胞術(shù),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染反義質(zhì)粒的SW620(as-hFL)細(xì)胞對Jurkat細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)較未轉(zhuǎn)染對照和空載體對照有明顯降低.總之,體外實(shí)驗(yàn)研究表明,大腸癌細(xì)胞能夠通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡,封閉腫瘤細(xì)胞的FasL表達(dá)可以抑制其對淋巴細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng),采用包括反義基因治療在內(nèi)的針對Fas