抗菌肽對(duì)基因Fas-FasL的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、抗菌肽(APMs)是一種新型的抗生素藥物，屬于小分子多肽，具有廣譜抗菌活性，對(duì)真菌，細(xì)菌，病毒及癌細(xì)胞均有很強(qiáng)的殺傷作用，而且不會(huì)引起病原菌的耐藥性。可以加快傷口的愈合，提高集體的免疫力，可以作為免疫調(diào)節(jié)因子，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定與平衡。
　　本實(shí)驗(yàn)需要檢測(cè)的目標(biāo)基因是Fas/FasL，F(xiàn)as位于細(xì)胞膜表面的跨膜受體，其配體FasL與其結(jié)合可以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。據(jù)有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as/FasL凋亡途徑與腫瘤

2、免疫逃逸有關(guān)，F(xiàn)as依賴性細(xì)胞凋亡途徑是由Fas受體與它的配體FasL的同源性相互作用調(diào)節(jié)的。正常情況下，活化的T淋巴細(xì)胞以外的分泌體產(chǎn)生的FasL與腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體Fas結(jié)合，可以啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的程序性死亡。除此之外，F(xiàn)as/FasL基因還可以充當(dāng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)因子，當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)信號(hào)刺激時(shí)，表達(dá)FasL分子的細(xì)胞就會(huì)與攜帶Fas抗原的細(xì)胞結(jié)合，輔助免疫細(xì)胞維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。本文著重介紹了用不同濃度的抗菌肽處理體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞RA

3、W，以及人工喂養(yǎng)小鼠，然后在細(xì)胞水平及動(dòng)物水平檢測(cè)目標(biāo)基因Fas/FasL表達(dá)量的變化，來(lái)驗(yàn)證抗菌肽對(duì)免疫調(diào)節(jié)的影響。涉及到的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下:
　　首先進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，用不同濃度的抗菌肽處理巨噬細(xì)胞RAW以及成正常體細(xì)胞纖維細(xì)胞3T3，在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞活力值的變化情況，來(lái)說(shuō)明抗菌肽對(duì)免疫細(xì)胞的影響，然后利用試劑盒提取藥物處理過(guò)的兩種細(xì)胞的RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增，及實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部Fas/FasL基因

4、各自的變化趨勢(shì)。
　　其次，提取經(jīng)過(guò)抗菌肽處理過(guò)的細(xì)胞的總蛋白，對(duì)其進(jìn)行Western blot蛋白水平半定量檢測(cè)，觀察由Fas/FasL編碼翻譯表達(dá)的蛋白量的變化，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證抗菌肽對(duì)基因Fas/FasL的影響。
　　最后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)從動(dòng)物組織提取出來(lái)的免疫細(xì)胞，利用帶有不同熒光物質(zhì)的Fas，F(xiàn)asL抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度來(lái)說(shuō)明目標(biāo)蛋白表達(dá)量的變化趨勢(shì)?；騀as/FasL表達(dá)量及其編碼蛋白表達(dá)量的