睪酮經(jīng)Fas-FasL信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞凋亡.pdf

1、凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡，通過這一先天機(jī)制機(jī)體可以清除一些不需要的細(xì)胞。與壞死不同，凋亡是一種最普遍的生理性細(xì)胞死亡，通常發(fā)生于胚胎發(fā)育，組織重塑，免疫調(diào)控以及腫瘤衰退過程中。巨噬細(xì)胞作為一種重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其在機(jī)體免疫中的作用不可忽視，巨噬細(xì)胞的正常凋亡對(duì)其正常行使功能有著重要的意義。很多因素可以影響巨噬細(xì)胞的凋亡，其中性激素是一個(gè)不可忽視的因素。過去的研究表明睪酮（Te）能直接引起小鼠骨髓巨噬細(xì)胞（BMM）凋亡，并伴有Fas和F

2、asL表達(dá)的升高，那么，在睪酮誘導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞凋亡中Fas下游的一些關(guān)鍵的酶是否也參與了此過程？ 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1．探究睪酮誘導(dǎo)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，F(xiàn)as/FasL途徑上caspase-8、caspase-3和PARP的表達(dá)情況。 2．阻斷Fas/FasL途徑中接頭蛋白FADD的表達(dá)后，下游因子caspase-8表達(dá)的變化。 實(shí)驗(yàn)方法： 無(wú)菌條件下分離3周齡雌性小鼠骨髓細(xì)胞，用含有生長(zhǎng)

3、因子M-CSF的L929條件培養(yǎng)基（LCM）誘導(dǎo)5天，使之向巨噬細(xì)胞定向分化。用流式細(xì)胞儀測(cè)定巨噬細(xì)胞純度并分選出F4/80陽(yáng)性細(xì)胞，并將細(xì)胞分為兩大組。第一組分別是空白對(duì)照組，睪酮（100nM，下同）處理組，去除M-CSF組，去除M-CSF同時(shí)用雄激素處理組。第二組用FADD反義寡核苷酸（ASODN）轉(zhuǎn)染BMMs后，重復(fù)第一組的四個(gè)處理組，并以FADD錯(cuò)義寡核苷酸（MSODN）轉(zhuǎn)染后的睪酮處理組作為對(duì)照。處理12小時(shí)后，分別通過凋亡梯

4、形和流式細(xì)胞儀檢測(cè)第一、第二組中BMMs的凋亡情況。最后通過RT-PCR、Real-time RT-PCR和Western Blot 方法檢測(cè)各組中caspase-8、caspase-3和PARP基因及蛋白的表達(dá)情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，67.2％的貼壁細(xì)胞是F4/80陽(yáng)性細(xì)胞，最大百分率可達(dá)69.7％。這些F4/80陽(yáng)性細(xì)胞即BMMs。在第一組中，除對(duì)照組外，其他三組均出現(xiàn)了明顯的凋亡梯形。第二組中，經(jīng)FA

5、DD-ASODN處理的細(xì)胞，其凋亡率明顯低于FADD-MSODN組。Real-time RT-PCR和Western Blot結(jié)果也顯示，在睪酮誘導(dǎo)下，BMMs中caspase-8、caspase-3和 PARP的表達(dá)增高并激活蛋白酶原生成小片段；而FADD的反義寡核苷酸能夠部分阻斷由睪酮誘導(dǎo)的BMMs的凋亡，使得caspase-8的表達(dá)也相應(yīng)減少。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1．睪酮在體外直接作用于小鼠骨髓巨噬細(xì)胞后，可誘導(dǎo)其凋亡。