放射誘導(dǎo)定向基因治療阻斷肺放射性纖維化的體外實驗研究.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文放射誘導(dǎo)定向基因治療阻斷肺放射性纖維化的體外實驗研究姓名：蔡旭偉申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：傅小龍20040426法檢測Smad7蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位，成纖維細(xì)胞再經(jīng)TGF—B1刺激后通過3H一胸腺嘧啶核苷(3H—TdR)和3H脯氨酸(3HProline)結(jié)合法檢測比較實驗組和對照組細(xì)胞增殖能力和膠原合成情況，采用液體閃爍計數(shù)法測定cpm(countsperminute，每分鐘閃爍計數(shù))值進(jìn)行定量比較。

2、結(jié)果：經(jīng)酶切、PCR及測序簽定證實成功構(gòu)建了含Egr1基因啟動子和Smad7eDNA的重組復(fù)制缺陷型腺病毒pAdES。病毒滴度為1010“TCID5n／ml。感染重組腺病毒的靶細(xì)胞經(jīng)不同劑量的深部x線照射后Smad7蛋白表達(dá)量存在一定的時問、劑量差異：實驗組中Smad7蛋白表達(dá)量隨著照射劑量的增加而增加，在劑量為8—15GY之問維持一個較高的表達(dá)水平，高于對照紐相應(yīng)劑量點處的Smad7蛋白量(P值皆小于O05)；在8Gy劑量照射后實驗組

3、Smad7蛋自表達(dá)量2h后升高，2h到7h之間維持在一個較高水平，顯著高于對照組艄應(yīng)時間點的Smad7蛋白表達(dá)量(P值皆小于O01)，爾后表達(dá)量丌始下降。細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示內(nèi)源性及外源性Smad7蛋白表達(dá)都定位丁細(xì)胞漿內(nèi)。同位素3H—Proline檢測結(jié)果顯示實驗組cpm值為3287，對照組cpm值為7941，兩者有明顯差別(P—o000)，空白組cpm值為3625，與實驗組無明顯差別(P—O741)，說明實驗組成纖維細(xì)胞膠原合成量明

4、顯低于對照組，與基石；|；水平相當(dāng)。3HTdR榆測結(jié)果顯示各組間細(xì)胞增殖能力無明顯差別(P=0312)。結(jié)論一J=__述結(jié)果表明，通過基因工程制備的重組復(fù)制缺陷型腺病毒具有生物學(xué)活性，在感染成纖維細(xì)胞后可通過放射線激活啟動予調(diào)控Smad7eDNA表達(dá)Smad7蛋白阻斷TGFpl刺激成纖維細(xì)胞膠原合成增加的作用。為下一步研究該重組腺病毒是否能阻斷小鼠放射性肺纖維化的動物實驗奠定了堅實的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞Smad7，Egtl基因啟動子，腺病毒，放