放射誘導定向基因治療阻斷肺放射性纖維化的體外實驗研究.pdf

1、復旦大學碩士學位論文放射誘導定向基因治療阻斷肺放射性纖維化的體外實驗研究姓名：蔡旭偉申請學位級別：碩士專業(yè)：腫瘤學指導教師：傅小龍20040426法檢測Smad7蛋白在細胞內的表達定位，成纖維細胞再經TGF—B1刺激后通過3H一胸腺嘧啶核苷(3H—TdR)和3H脯氨酸(3HProline)結合法檢測比較實驗組和對照組細胞增殖能力和膠原合成情況，采用液體閃爍計數法測定cpm(countsperminute，每分鐘閃爍計數)值進行定量比較。

2、結果：經酶切、PCR及測序簽定證實成功構建了含Egr1基因啟動子和Smad7eDNA的重組復制缺陷型腺病毒pAdES。病毒滴度為1010“TCID5n／ml。感染重組腺病毒的靶細胞經不同劑量的深部x線照射后Smad7蛋白表達量存在一定的時問、劑量差異：實驗組中Smad7蛋白表達量隨著照射劑量的增加而增加，在劑量為8—15GY之問維持一個較高的表達水平，高于對照紐相應劑量點處的Smad7蛋白量(P值皆小于O05)；在8Gy劑量照射后實驗組

3、Smad7蛋自表達量2h后升高，2h到7h之間維持在一個較高水平，顯著高于對照組艄應時間點的Smad7蛋白表達量(P值皆小于O01)，爾后表達量丌始下降。細胞免疫化學結果顯示內源性及外源性Smad7蛋白表達都定位丁細胞漿內。同位素3H—Proline檢測結果顯示實驗組cpm值為3287，對照組cpm值為7941，兩者有明顯差別(P—o000)，空白組cpm值為3625，與實驗組無明顯差別(P—O741)，說明實驗組成纖維細胞膠原合成量明

4、顯低于對照組，與基石；|；水平相當。3HTdR榆測結果顯示各組間細胞增殖能力無明顯差別(P=0312)。結論一J=__述結果表明，通過基因工程制備的重組復制缺陷型腺病毒具有生物學活性，在感染成纖維細胞后可通過放射線激活啟動予調控Smad7eDNA表達Smad7蛋白阻斷TGFpl刺激成纖維細胞膠原合成增加的作用。為下一步研究該重組腺病毒是否能阻斷小鼠放射性肺纖維化的動物實驗奠定了堅實的基礎。關鍵詞Smad7，Egtl基因啟動子，腺病毒，放