間充質(zhì)干細胞基因治療甲狀旁腺功能減退的實驗研究.pdf

1、甲狀旁腺功能減退是指具有生物活性的甲狀旁腺素（ parathyroid hormone，PTH）分泌不足，或者不能使靶器官產(chǎn)生生理效應(yīng)，其特點是血鈣降低，血磷增高，血中PTH減少或測不出，并表現(xiàn)出神經(jīng)肌肉興奮性增加的臨床癥狀。多數(shù)甲狀旁腺功能減退為繼發(fā)性，主要發(fā)生在甲狀腺或甲狀旁腺手術(shù)后，由于術(shù)中誤傷或切除甲狀旁腺所致。甲狀旁腺功能減退的臨床癥狀主要取決于血鈣降低的程度與持續(xù)時間及下降的速度。主要的臨床表現(xiàn)包括指端或嘴周麻木或刺痛，手足

2、與面部肌肉痙攣，繼之出現(xiàn)手足搐搦（血清鈣一般在2mmol/L以下），有些患者可出現(xiàn)癲癇樣神經(jīng)癥狀，嚴重降低患者的生活質(zhì)量。本課題通過基因工程方法制備表達PTH的脂肪間充質(zhì)干細胞，觀察其對甲狀旁腺功能減退的治療作用，探索細胞治療甲狀旁腺功能減退的新途徑。
　　一、大鼠甲狀旁腺功能減退模型的建立
　　目的：建立 SD大鼠甲狀旁腺功能減退的模型。
　　方法：應(yīng)用納米炭負顯影技術(shù)于術(shù)中顯示甲狀旁腺，行甲狀旁腺切除術(shù)，切除標本行

3、光學相干斷層掃描（OCT）及病理染色，記錄術(shù)后一般情況改變，評估血清鈣及PTH變化情況。
　　結(jié)果：納米炭負顯影可于術(shù)中清楚辨認甲狀旁腺，切除組織經(jīng)OCT成像及病理染色分析證實為甲狀旁腺組織。術(shù)后第1，5，10天，實驗組血鈣分別為1.79±0.09，1.63±0.07，1.61±0.13 mmol/L，血PTH水平分別為13.16±3.02，15.24±4.46，15.91±5.76 ng/L，均顯著低于對照組（P＜0.05）。<

4、br>　　二、基因工程方法制備表達PTH的間充質(zhì)干細胞的研究
　　目的：構(gòu)建突變型PTH慢病毒載體，用純化濃縮后的慢病毒顆粒感染大鼠間充質(zhì)干細胞（MSCs），從而獲得表達PTH的MSCs。
　　方法：用DNA聚合酶將前甲狀旁腺激素原（preproPTH）基因連接入慢病毒載體質(zhì)粒，PCR定點突變法突變出Furin酶切位點，載體構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)染293T細胞，收獲慢病毒顆粒并進行純化、濃縮；采用Ⅰ型膠原酶消化大鼠脂肪組織，獲得大鼠脂

5、肪間充質(zhì)干細胞（ASCs），定向誘導分化鑒定；用慢病毒對大鼠 MSCs進行轉(zhuǎn)導，檢測感染后MSCs培養(yǎng)上清液中PTH的表達量。
　　結(jié)果：成功從脂肪組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞；表達PTH的慢病毒經(jīng)濃縮后，滴度達到2.5×107TU/ml，可以成功感染間充質(zhì)干細胞，感染后上清中 PTH濃度達到44.09±2.33 pg/ml。
　　三、間充質(zhì)干細胞基因治療甲狀旁腺功能減退的實驗研究
　　目的：觀察表達PTH的間充質(zhì)干細

6、胞對大鼠甲狀旁腺功能減退的治療作用。
　　方法：運用納米炭輔助建立大鼠甲狀旁腺功能減退模型，術(shù)后立即給予皮下注射表達 PTH的間充質(zhì)干細胞（PTH-MSCs），并與注射未經(jīng)修飾的間充質(zhì)干細胞（MSCs）及注射生理鹽水（NS）的大鼠進行比較；觀察不同組大鼠一般情況變化及生存率改變；檢測三組大鼠術(shù)后血鈣及血PTH變化情況；采用RT-PCR法檢測術(shù)后mPTH基因體內(nèi)表達情況。
　　結(jié)果：PTH-MSCs治療組大鼠術(shù)后精神良好，無大

7、鼠出現(xiàn)抽搐現(xiàn)象，術(shù)后5 d、10 d血鈣分別為2.05±0.07，2.01±0.20 mmol/L，血PTH分別為23.30±5.11，25.41±6.86ng/L，均顯著高于MSCs組和NS組（P＜0.05），至術(shù)后30天內(nèi)只有一只大鼠死亡；MSCs組及NS組大鼠術(shù)后精神萎靡，分別有4例（4/6）和3例（3/6）出現(xiàn)抽搐，在觀察期內(nèi)全部死亡。
　　結(jié)論：將人prepro-PTH基因信號肽突變出Furin蛋白酶酶切位點，可實現(xiàn)有活