IL-10基因修飾的大鼠肝細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制.pdf

1、目的研究大鼠肝細(xì)胞及白細(xì)胞介素-10(IL-10)對(duì)原代肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖、活化及凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制。 方法用RT-巢式PCR方法獲取大鼠IL-10基因的全長(zhǎng)編碼序列，采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建其真核表達(dá)載體pcDNA3.0-rIL-10，并進(jìn)行雙酶切法及測(cè)序鑒定。通過(guò)有或無(wú)去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞系BRL，采用RT-PCR及ELISA方法觀察IL-10 mRNA和分泌型IL-10蛋白的表

2、達(dá)情況，用MTT法及流式細(xì)胞分析法檢測(cè)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的BRL細(xì)胞的增殖、凋亡情況。分別將正常的、轉(zhuǎn)染pcDNA3.O空質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-rIL-10質(zhì)粒的BRL細(xì)胞與原代HSC共培養(yǎng)，通過(guò)相差顯微鏡下觀察、MTT、原位末端標(biāo)記檢測(cè)(TUNEL)、western blot等方法觀察各組HSC的表型變化、增殖、凋亡、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及Ⅰ型前膠原的表達(dá)。用抗體芯片技術(shù)檢測(cè)各組BRL細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的表

3、達(dá)差異。 結(jié)果成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.0-rIL-10，并轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞，獲得高水平的IL-10表達(dá)，而后者抑制了BRL細(xì)胞的凋亡。發(fā)現(xiàn)受體介導(dǎo)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率明顯高于非受體介導(dǎo)的脂質(zhì)體。BRL細(xì)胞顯著促進(jìn)HSC的增殖、凋亡以及α-SMA和I型前膠原的表達(dá)，使HSC的脂滴消失加速，收縮性增強(qiáng)。IL-10則抑制HSC的增殖、以及α-SMA和Ⅰ型前膠原的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)HSC的凋亡?？贵w芯片顯示，BRL細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中血管內(nèi)

4、皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)等三種細(xì)胞因子顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-rIL-10質(zhì)粒的BRL細(xì)胞較之轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒者IL-10顯著上調(diào)，VEGF下調(diào)。結(jié)論受體介導(dǎo)的脂質(zhì)體對(duì)肝細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染活性，可能成為IL-10基因治療肝纖維化的有效轉(zhuǎn)染載體。肝細(xì)胞促進(jìn)HSC的增殖與活化，其機(jī)制可能與其表達(dá)VEGF、MCP-1、TIMP-1等細(xì)胞因子有關(guān)。IL-10可抑制HSC的增