大鼠肝細(xì)胞IL-10及其受體的表達(dá)與作用.pdf

1、目的: 通過建立大鼠肝纖維化及IL-10干預(yù)模型，研究肝纖維化大鼠肝組織中IL-10的表達(dá)和變化，探討外源性IL-10對(duì)肝細(xì)胞的作用；通過外源性IL-10對(duì)原代肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)干預(yù)，了解IL-10對(duì)肝細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并分析其相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)變化。 方法: 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分：建立大鼠肝纖維化和IL-10干預(yù)模型，抽提肝臟總RNA，Real-Time PCR法檢測(cè)模型組與正常組IL-10表達(dá)的差異，原位Tunnel

2、法檢測(cè)IL-10對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響；免疫組織化學(xué)法、RT-PCR檢測(cè)肝組織Bax/Bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)。 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分：通過膠原蛋白酶原位灌流法分離大鼠原代肝細(xì)胞，RT-PCR法檢測(cè)肝內(nèi)不同細(xì)胞標(biāo)志基因，如：ALB、CK19、AFP、CYP881、CD68、CD31等基因的表達(dá)情況，并進(jìn)行細(xì)胞純度鑒定、凍存研究、復(fù)蘇培養(yǎng)、細(xì)胞活性鑒定等；RT-PCR、Western-blot檢測(cè)原代肝細(xì)胞IL-10/IL-10R1 m

3、RNA和蛋白的表達(dá)情況；原代肝細(xì)胞分三組培養(yǎng)：正常組(N組，普通培養(yǎng)基)、對(duì)照組(C組，含胰島素培養(yǎng)基)和IL-10干預(yù)組(Ⅰ組，含IL-10、胰島素的培養(yǎng)基)，通過MTT分析、臺(tái)盼蘭細(xì)胞計(jì)數(shù)以及流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期、流式AnnexinV、AO-EB法等檢測(cè)手段，了解外源性IL-10對(duì)原代肝細(xì)胞增殖與凋亡的影響；同時(shí)，半定量RT-PCR法分析lL-10對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果: 成功構(gòu)建大鼠肝纖維

4、化及IL-10治療模型，Real-Time PCR結(jié)果提示，纖維化組肝組織IL-10mRNA的表達(dá)較正常組下降(P<0.01)；原位TUNEL法檢測(cè)顯示，IL-10治療組肝細(xì)胞凋亡數(shù)量較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)。免疫組化檢測(cè)提示IL-10治療組Bax表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)；RT-PCR結(jié)果顯示治療組較對(duì)照組Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)均下調(diào)(Bax: P<0.05；Bcl-2: P<0.01)。 成功分離

5、大鼠原代肝細(xì)胞，細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示肝細(xì)胞純度高，凍存復(fù)蘇培養(yǎng)的細(xì)胞活度良好，可檢測(cè)到IL-10/IL-10R1mRNA和IL-10蛋白的表達(dá)。細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，凍存培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞細(xì)胞周期高度同步化；MTT檢測(cè)顯示IL-10干預(yù)48 h，I組吸光度值分別為C組的88.410-/0(P<0.05)；臺(tái)盼蘭細(xì)胞計(jì)數(shù)亦提示IL-10干預(yù)48 h，Ⅰ組平均細(xì)胞數(shù)僅為C組的71.96％(P<0.05)；流式細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，IL-10干預(yù)24

6、h，Ⅰ組平均細(xì)胞DNA含量是C組的59.06％，Ⅰ組較C組降低(P<0.01)，甚至低于正常組(P<0.01)；AO-EB法、AnnexinV法檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示原代培養(yǎng)肝細(xì)胞凋亡數(shù)量較少。半定量RT-PCR檢測(cè)原代肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子中，僅IGF-1 mRNA呈穩(wěn)定高表達(dá)，培養(yǎng)至24h、48h，Ⅰ組IGF-1相對(duì)含量分別為C組的87.38％、89.43％，差別顯著(P<0.01)。 結(jié)論：肝細(xì)胞可自分泌IL-10，肝纖維化大鼠肝組織I