大鼠肝細胞IL-10及其受體的表達與作用.pdf

1、目的: 通過建立大鼠肝纖維化及IL-10干預模型，研究肝纖維化大鼠肝組織中IL-10的表達和變化，探討外源性IL-10對肝細胞的作用；通過外源性IL-10對原代肝細胞進行培養(yǎng)干預，了解IL-10對肝細胞增殖、凋亡的影響，并分析其相關(guān)生長因子的表達變化。 方法: 動物實驗部分：建立大鼠肝纖維化和IL-10干預模型，抽提肝臟總RNA，Real-Time PCR法檢測模型組與正常組IL-10表達的差異，原位Tunnel

2、法檢測IL-10對肝細胞凋亡的影響；免疫組織化學法、RT-PCR檢測肝組織Bax/Bcl-2蛋白及mRNA的表達。 細胞實驗部分：通過膠原蛋白酶原位灌流法分離大鼠原代肝細胞，RT-PCR法檢測肝內(nèi)不同細胞標志基因，如：ALB、CK19、AFP、CYP881、CD68、CD31等基因的表達情況，并進行細胞純度鑒定、凍存研究、復蘇培養(yǎng)、細胞活性鑒定等；RT-PCR、Western-blot檢測原代肝細胞IL-10/IL-10R1 m

3、RNA和蛋白的表達情況；原代肝細胞分三組培養(yǎng)：正常組(N組，普通培養(yǎng)基)、對照組(C組，含胰島素培養(yǎng)基)和IL-10干預組(Ⅰ組，含IL-10、胰島素的培養(yǎng)基)，通過MTT分析、臺盼蘭細胞計數(shù)以及流式細胞儀細胞周期、流式AnnexinV、AO-EB法等檢測手段，了解外源性IL-10對原代肝細胞增殖與凋亡的影響；同時，半定量RT-PCR法分析lL-10對大鼠原代肝細胞生長因子mRNA表達的影響。 結(jié)果: 成功構(gòu)建大鼠肝纖維

4、化及IL-10治療模型，Real-Time PCR結(jié)果提示，纖維化組肝組織IL-10mRNA的表達較正常組下降(P<0.01)；原位TUNEL法檢測顯示，IL-10治療組肝細胞凋亡數(shù)量較對照組明顯降低(P<0.01)。免疫組化檢測提示IL-10治療組Bax表達較對照組顯著降低(P<0.01)；RT-PCR結(jié)果顯示治療組較對照組Bax/Bcl-2 mRNA表達均下調(diào)(Bax: P<0.05；Bcl-2: P<0.01)。 成功分離

5、大鼠原代肝細胞，細胞鑒定結(jié)果顯示肝細胞純度高，凍存復蘇培養(yǎng)的細胞活度良好，可檢測到IL-10/IL-10R1mRNA和IL-10蛋白的表達。細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，凍存培養(yǎng)的原代肝細胞細胞周期高度同步化；MTT檢測顯示IL-10干預48 h，I組吸光度值分別為C組的88.410-/0(P<0.05)；臺盼蘭細胞計數(shù)亦提示IL-10干預48 h，Ⅰ組平均細胞數(shù)僅為C組的71.96％(P<0.05)；流式細胞周期檢測結(jié)果表明，IL-10干預24

6、h，Ⅰ組平均細胞DNA含量是C組的59.06％，Ⅰ組較C組降低(P<0.01)，甚至低于正常組(P<0.01)；AO-EB法、AnnexinV法檢測細胞凋亡顯示原代培養(yǎng)肝細胞凋亡數(shù)量較少。半定量RT-PCR檢測原代肝細胞生長因子中，僅IGF-1 mRNA呈穩(wěn)定高表達，培養(yǎng)至24h、48h，Ⅰ組IGF-1相對含量分別為C組的87.38％、89.43％，差別顯著(P<0.01)。 結(jié)論：肝細胞可自分泌IL-10，肝纖維化大鼠肝組織I