大鼠膿毒癥肝損傷時(shí)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、白介素10(IL-10)的表達(dá)和意義.pdf

1、目的：膿毒癥是由于感染而誘發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)，是外科常見的并發(fā)癥。膿毒癥早期如果持續(xù)的全身性炎癥反應(yīng)得不到有效的控制，常常并發(fā)多臟器功能不全綜合癥(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，而MODS的終末表現(xiàn)是形成多臟器功能衰竭(multiple organ failure，MOF)，這是需要外科監(jiān)護(hù)的重癥患者死亡的主要原因。盡管現(xiàn)代外科監(jiān)護(hù)技術(shù)和抗生素治療有了很大發(fā)展，但是，膿毒癥的死亡率仍

2、然很高，文獻(xiàn)報(bào)道在非休克患者中，其死亡率為30％—40％，而在休克患者中其死亡率則達(dá)到70％—90％，因此，膿毒癥及其并發(fā)的臟器功能不全的防治，仍然是當(dāng)代外科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究方向和尚待攻克的難題之一。 感染所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是大量促炎性細(xì)胞因子過度活化所引起的全身炎癥反應(yīng)已是多數(shù)學(xué)者的共識(shí)，近年來又發(fā)現(xiàn)在炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的同時(shí)伴有多

3、種抗炎因子如白細(xì)胞介素10(IL-10)、白細(xì)胞介素4(IL—4)等的釋放，過量抗炎因子會(huì)導(dǎo)致代償性抗炎反應(yīng)綜合征(compensatory anti—inflammatory response syndrome，CARS)，繼而導(dǎo)致過度的免疫抑制而使感染失控。最近的研究中，發(fā)現(xiàn)在促炎細(xì)胞因子中，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitor factor，MIF)被認(rèn)為是炎癥發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)，它可

4、以誘導(dǎo)生成多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生如腫瘤壞死因子(TNF—α)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素6(IL—6)等，從而引發(fā)炎癥細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)釋放，進(jìn)而對(duì)機(jī)體的炎癥反應(yīng)形成級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。IL-10是一種重要的內(nèi)源性抗炎細(xì)胞因子，參與抑制細(xì)胞合成炎性因子，在膿毒血癥的病理生理過程中起著維持炎癥平衡，防止炎癥過度而造成器官損傷的作用。本項(xiàng)目研究的目的在于為研究膿毒癥肝臟損傷中此兩種炎癥因子的表達(dá)水平及損傷機(jī)制方面提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床防治

5、和預(yù)測(cè)膿毒癥轉(zhuǎn)歸提供新的線索。 方法：1.應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)建立大鼠膿毒癥病理模型。選用SD大鼠，3-5月齡，體重180-250克，雄性，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將動(dòng)物分為二組(實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組)，在不同時(shí)相(2h、6h、12h、24h)分別取材。2.取出部分肝臟組織置于10％的甲醛中固定，常規(guī)病理檢查，HE染色，觀察肝臟組織在不同時(shí)間組的過程中病理結(jié)構(gòu)改變。另外一部分置于凍存管，—80℃低溫冰箱保存。3.抽取大鼠血

6、液，離心后提取血清，置于EP管放入—20℃冰箱保存。取出一部分應(yīng)用血液生化分析方法檢測(cè)各個(gè)時(shí)相組大鼠血液中ALT、TBIL的變化。4.按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法試劑盒說明書步驟操作，最后置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)其OD值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血液中MIF、IL-10水平。 5.應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)檢測(cè)肝臟組織MIF、IL-10在mRNA上的表達(dá)水平的變化：通過TRIZOL法提取肝臟組織RNA(Invitrogen)，

7、逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(Fermentas)，運(yùn)用PCR儀擴(kuò)增出DNA(體系25μl)： IL-10引物：上游5’—CTGGACAACATACTGCTAACCGAC—3’，下游5’—ATTCATTCATGGCCTTGTA—GACACC—3’，MIF引物：上游5'—CCGTGCCAGAGGGGTTT—3’，下游5’—GGCTGC—GTTCATGTCGTAA—3’，內(nèi)參為β—actin。循環(huán)條件：94℃30sec，55℃30sec，72℃min，

8、循環(huán)次數(shù)為33。完成擴(kuò)增后在瓊脂糖膠上電泳，置于凝膠成像儀上分析其灰度值。 結(jié)果：1.膿毒癥早期出現(xiàn)外周血促炎細(xì)胞因子濃度增高，提示體內(nèi)存在促炎細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)。在大鼠膿毒癥模型中，我們觀察到前促炎癥因子MIF在造模后2h即升高(P<0.05)，6h達(dá)到峰值；抗炎因子IL-10在造模后2h逐漸升高(P<0.05)，在12h時(shí)達(dá)到濃度峰值。2.對(duì)肝臟標(biāo)本行常規(guī)病理切片觀察，觀察到在2h、6h、12h、24h時(shí)肝臟病變逐漸加重，提示

9、肝臟損傷隨著膿毒癥的進(jìn)展而逐漸加重。3.對(duì)血清生化指標(biāo)(ALT、TBIL)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠ALT、TBIL隨著造模時(shí)間的延長而逐漸升高，提示肝臟損傷逐漸加重。4.CLP模型上可復(fù)制出膿毒癥的臨床及病理生理過程；從血清及組織炎性細(xì)胞因子的變化、器官功能損害和組織形態(tài)學(xué)損傷等不同的側(cè)面都證實(shí)了膿毒癥中促炎癥因子MIF與抗炎因子IL-10之間的相關(guān)性(MIFmRNA/ IL-10mRNA：r=0.807 P<0.05，MIF/IL-10：r=0.

10、655 P<0.05)，及與肝臟損傷密切相關(guān)(MIFmRNA/ALT：r=0.39 P<0.05，IL-10mRNA/ALT：r=0.545 P<0.05，MIF/ALT：r=0.49 P<0.05，IL-10/ALT： r=0.461 P<0.05，MIFmRNA/TBIL：r=0.596 P<0.05，IL-10mRNA/TBIL：r=0.553，P<0.05，MIF/TBIL：r=0.575，P<0.05，IL-10/TBIL：r