RasGRP4調(diào)節(jié)NK細(xì)胞分泌IFN-γ的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　2型糖尿病患者已成為感染以及惡性腫瘤的高危人群。NK細(xì)胞活性降低、IFN-γ分泌障礙是2型糖尿病免疫功能低下的重要表現(xiàn)。但目前對(duì)于2型糖尿病患者NK細(xì)胞分泌干擾素-γ（IFN-γ）受損機(jī)制尚知之甚少。Ras鳥(niǎo)嘌呤釋放蛋白-4(RasGRP4)是一個(gè)近年在肥大細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的新的信號(hào)蛋白。并且RasGRP4曾一直被認(rèn)為是肥大細(xì)胞特異性的信號(hào)蛋白。課題組前期研究證實(shí)，RasGRP4通過(guò)與CD117信號(hào)相互作用，調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞的功

2、能。成熟的肥大細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞均可表達(dá)CD117，并且肥大細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，均可作為NK細(xì)胞的輔助細(xì)胞參與調(diào)節(jié)IFN-γ的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上本研究提出假說(shuō):RasGRP4也是一個(gè)CD117刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞重要的信號(hào)蛋白，在LPS的刺激下，通過(guò)CD117+DC-NK細(xì)胞間的相互作用，參與調(diào)節(jié)IFN-γ的產(chǎn)生。本研究擬證實(shí)該假說(shuō)。
　　方法:
　　在采用同源重組技術(shù)成功建立RasGRP4基因敲除動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):觀察

3、RasGRP4基因敲除對(duì)小鼠脾臟以及淋巴結(jié)大小的影響和外周血白細(xì)胞的數(shù)量、分類以及亞類分類的影響。采用流式芯片技術(shù)檢測(cè)了RasGRP4基因敲除對(duì)小鼠在LPS刺激下炎癥因子分泌水平的變化、外周血以及脾細(xì)胞中IFN-γ分泌細(xì)胞的變化情況。體外實(shí)驗(yàn):通過(guò)提取RasGRP4基因敲除小鼠和WT小鼠脾細(xì)胞進(jìn)一步驗(yàn)證RasGRP4對(duì)LPS刺激下小鼠脾細(xì)胞IFN-γ等炎性因子分泌的影響。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)，分析了CD117+細(xì)胞的表型特征以及分析表達(dá)

4、RasGRP4的CD117+細(xì)胞亞群。進(jìn)一步提取NK細(xì)胞、CD117+DC細(xì)胞，檢測(cè)在LPS刺激下共培養(yǎng)后炎性因子的表達(dá)情況。采用Transwell實(shí)驗(yàn)和OX40L抗體阻斷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析NK細(xì)胞、CD117+DC細(xì)胞的作用方式與IFN-γ分泌的關(guān)系。采用多重懸液芯片技術(shù)檢測(cè)了RasGRP4對(duì)CD117+DC細(xì)胞在LPS刺激下分泌免疫調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而采用抗體阻斷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證該免疫調(diào)節(jié)因子對(duì)NK細(xì)胞分泌IFN-γ的影響。并采用基因

5、芯片技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)了RasGRP4對(duì)CD117+DC細(xì)胞在LPS刺激下TLRs信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.RasGRP4基因敲除小鼠和WT小鼠脾臟和淋巴結(jié)的重量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.RasGRP4基因敲除小鼠外周血與脾臟T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞的數(shù)目較對(duì)照組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.RasGRP4基因敲除小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞中cDCs比例較WT小鼠明顯減少。
　　4.

6、LPS刺激下，WT小鼠血漿中IFN-γ水平較RasGRP4基因敲除小鼠升高5-10倍。
　　5.RasRP4基因敲除小鼠在LPS刺激下，外周血IFN-γ+的NK1.1顯著減少至WT小鼠的30％。
　　6.RasGRP4基因敲除小鼠LPS刺激脾臟分泌IFN-γ的NK1.1細(xì)胞數(shù)量較WT小鼠減少約50％。
　　7.RasGRP4基因敲除小鼠脾細(xì)胞在LPS刺激分泌IFN-γ水平較WT小鼠明顯降低。
　　8.CD117+

7、CD11C+CD11b+cDCs亞群是小鼠脾細(xì)胞中CD117+細(xì)胞主要亞群，也是表達(dá)RasGRP4的樹(shù)突狀細(xì)胞亞群。
　　9.CD117+DCs可以濃度依賴和時(shí)間依賴的方式促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN-γ，并且該作用依賴于RasGRP4。
　　10.CD117+DCs促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN-γ不依賴于DC-NK細(xì)胞間的直接接觸。
　　11.RasGRP4可通過(guò)促進(jìn)CD117+DCs分泌IL-1α、GM-CSF調(diào)節(jié)NK細(xì)胞分泌

8、IFN-γ。
　　12.WT來(lái)源的CD117+DCs可促進(jìn)RasGRP4-/-米源的NK細(xì)胞分泌IFN-γ。
　　13.RasGRP4可通過(guò)上調(diào)LPS刺激下的CD117+DCs的Pydc3等炎性小體、IL-1家族相關(guān)基因，以及增加干擾素效應(yīng)相關(guān)基因2'-5'oligoadenylate synthetase1A等的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　RasGRP4亦是CD117+的樹(shù)突狀細(xì)胞的重要的信號(hào)蛋白，對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分化

9、和功能起著重要的作用。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了RasGRP4這種新的信號(hào)蛋白在調(diào)控LPS刺激下的小鼠NK1.1細(xì)胞分泌IFN-γ的機(jī)制中起著極其重要的作用。并且，RasGRP4對(duì)NK細(xì)胞分泌IFN-γ的調(diào)控作用，依賴于CD117+DCs作為NK細(xì)胞的輔助細(xì)胞，經(jīng)上調(diào)CD117+DCs細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體的，從而促進(jìn)CD117+DCs分泌免疫調(diào)節(jié)因子，間接調(diào)控NK細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生和分泌。
　　本研究闡述了RasGR