大片吸蟲分泌排泄產(chǎn)物調(diào)節(jié)水牛外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-10特性的研究.pdf

1、大片吸蟲病(Fasciolosis)是一種常見的水牛寄生蟲病，了解水牛免疫細(xì)胞的各種特性，是防御水牛大片吸蟲病的基礎(chǔ)。 研究一：為選擇適宜的實(shí)驗(yàn)動物，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)篩選大片吸蟲陰性的9、15和24月齡的水牛各5頭。對所有實(shí)驗(yàn)動物的外周血細(xì)胞進(jìn)行總數(shù)計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)，同時分離出不同月齡(9、15和24月齡)健康水牛外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，與不同濃度的非特異刺激因子植物血凝素(PHA)和刀豆素A(ConA)(

2、0.125、0.25、0.5、1、2、3、4 μg/孔)進(jìn)行培養(yǎng)，采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)測定增殖能力，計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，9、15和24月齡組外周血細(xì)胞總數(shù)分別是17.1×109個/ml、16.4×109個/ml和16.5×109個/ml；其中淋巴細(xì)胞分別為9.7×109個/ml、9.1×109個/ml和7.9×109個/ml；嗜酸性粒細(xì)胞分別為0.3×109個/ml、0.1

3、×109個/ml和0.3×109個/ml。白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和總數(shù)計(jì)數(shù)在不同月齡水牛間的差異不顯著。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：9、15和24月齡組在PHA刺激下(0.125～3.000 μg/孔)SI隨PHA濃度的升高而增高，分別為1.3～3.3、1.0～3.0和1.5～3.6。各月齡組水牛細(xì)胞在ConA刺激下(0.125～4μg/孔)的SI隨ConA濃度的升高而增高，分別為1.0～1.5、1.1～1.6和1.0～1.6。PHA或ConA刺激下

4、的SI在不同月齡水牛間差異也不顯著。這提示9、15、24月齡水牛均適宜用作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。PHA刺激下的SI和ConA刺激下的SI在同一月齡水牛組內(nèi)差異顯著(P<0.05)，且PHA刺激下的SI比ConA刺激下的SI高。 研究二：為了了解非特異性刺激原(ConA、PHA、LPS)和FgESP對水牛PBMC表達(dá)IFN-γ和IL-10的水平的影響，及FgESP對各刺激因子的調(diào)節(jié)作用。從水牛膽囊中收集大片吸蟲成蟲并制備大片吸蟲分泌排泄產(chǎn)

5、物(FgESP)。應(yīng)用FgESP和非特異性刺激原(ConA、PHA、LPS)刺激15月齡水牛外周血單個核細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)有ConA、PHA、LPS、FgESP、FgESP+LPS、FgESP+ConA和FgESP+PHA 7個實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)有陰性對照。采用ELISA方法檢測各實(shí)驗(yàn)組及陰性對照組在各刺激原刺激6、12、24和48小時(h)下PBMC表達(dá)IFN-γ和IL-10的濃度，比較各組實(shí)驗(yàn)在不同時間段IFN-γ和IL-10的水平。結(jié)果顯示C

6、onA、PHA和LPS三者均于6h刺激水牛PBMC產(chǎn)生IFN-γ。PHA刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ出現(xiàn)的峰值最早(6h，83.41 pg/ml)，ConA刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ出現(xiàn)的峰值最晚(24h，87.76 pg/ml)。ConA、PHA和LPS三者在各時間段刺激細(xì)胞產(chǎn)生的IL一10都較少，與陰性對照比較差異不顯著。在ConA、PHA和LPS三組中，ConA刺激PBMC產(chǎn)生的IFN-γ最強(qiáng)(24h峰值，87.76 pg/ml)，LPS刺

7、激PBMC產(chǎn)生的IFN-γ最弱(6h峰值，47.5 pg/ml)。ESP單獨(dú)刺激PBMC檢測到的IFN-γ和IL-10都較少，與陰性比較差異都不顯著。FgESP+ConA、PHA+FgESP和FgESP+LPS三組實(shí)驗(yàn)分別與ConA、PHA和LPS三組實(shí)驗(yàn)相比，的IFN-γ區(qū)別都不明顯。FgESP+ConA和PHA+FgESP兩組實(shí)驗(yàn)分別與ConA和PHA實(shí)驗(yàn)組相比，IL-10都明顯升高(P<0.05)，升高的最高指數(shù)都在24h，分別為