大片吸蟲兩種排泄分泌蛋白的克隆、表達及其對山羊外周血單個核細胞功能影響的研究.pdf

1、片形吸蟲病(Fascioliasis)是由大片吸蟲和肝片吸蟲感染而引起的一種人獸共患寄生蟲病。據(jù)估計，全球每年由于片形吸蟲病造成的損失超過30億美元。此外，片形吸蟲病已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為被忽視的熱帶人類疾病之一，全球至少有240萬人感染片形吸蟲病，1.8億人處于感染風險中。可見，片形吸蟲病是影響世界公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)發(fā)展的重要問題。
　　在前期的片形吸蟲蛋白組學研究中發(fā)現(xiàn)，14-3-3家族相關蛋白(14-3-3e)和Ra

2、s家族相關蛋白(Rab-10)是大片吸蟲的排泄分泌蛋白(FgESPs)，且能夠在體內與山羊的外周血單個核細胞(PBMCs)結合。經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，14-3-3家族相關蛋白涉及寄生蟲的多種生物學過程，包括初級代謝、信號轉導、細胞周期調控、蛋白質運輸、轉錄和應激反應;Ras家族相關蛋白是多種信號轉導途徑的關鍵組成蛋白，在寄生蟲的生長發(fā)育過程中起重要作用。然而，有關大片吸蟲14-3-3e和Rab-10對山羊PBMCs功能的影響到目前為止還不清楚

3、。因此，本論文對大片吸蟲14-3-3e基因和Rab-10基因進行了克隆、表達和序列分析，探索了14-3-3e和Rab-10重組蛋白在體外對山羊PBMCs功能的影響。
　　通過對大片吸蟲14-3-3e基因和Rab-10基因的克隆、表達和序列分析，結果表明它們的大小分別為774bp和618bp，分別編碼257個和205個氨基酸殘基，相對分子量分別約為30kDa和23kDa;它們的序列分別與GenBank中肝片吸蟲14-3-3蛋白基因和

4、Ras家族相關蛋白基因的同源性分別為100％和99％;r14-3-3e重組蛋白為可溶性表達，而rRab-10重組蛋白為包涵體表達，且都具有較好的純化效果;分別用人工感染大片吸蟲的山羊血清進行Western-blot分析，結果表明這兩種重組蛋白都具有良好的免疫原性。
　　當兩種不同濃度的重組蛋白分別與山羊PBMCs共孵育后，通過采用間接免疫熒光技術(IFA)分別觀察它們與山羊PBMCs的結合情況，實驗結果表明這兩種重組蛋白都能與山羊

5、的PBMCs結合;通過應用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測山羊PBMCs IL-4、IL-10、TGF-β和IFN-γ的分泌情況，實驗結果表明r14-3-3e顯著抑制了山羊PBMCs IL-4和IFN-γ的分泌，顯著促進了IL-10和TGF-β的分泌，而rRab-10顯著促進了山羊PBMCs IL-4、IL-10、TGF-β和IFN-γ的分泌;通過采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測山羊PBMCs的增殖情

6、況，發(fā)現(xiàn)這兩種重組蛋白都能顯著抑制山羊PBMCs的增殖，通過采用遷移小室研究山羊PBMCs的遷移情況，實驗結果表明r14-3-3e顯著抑制了山羊PBMCs的遷移，而rRab-10顯著促進了山羊PBMCs的遷移;用總一氧化氮(NO)檢測試劑盒檢測山羊PBMCs的NO產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)這兩種重組蛋白都能顯著促進山羊PBMCs NO的產(chǎn)生，采用流式細胞儀檢測山羊單核細胞的吞噬能力，發(fā)現(xiàn)r14-3-3e顯著抑制了山羊單核細胞的吞噬能力，而rRab-