片形吸蟲及其分泌排泄產(chǎn)物對巨噬細胞極化和宿主細胞免疫應(yīng)答作用的研究.pdf

1、片形吸蟲的兩個致病種大片形吸蟲和肝片形吸蟲均能感染人和哺乳動物引起片形吸蟲病，不同宿主的易感性不同，這與片形吸蟲對宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控或逃避有關(guān)。肝片形吸蟲及其ESP已被證實能誘導小鼠和牛巨噬細胞的M2型極化，而大片形吸蟲在宿主中能否引起相似的免疫反應(yīng)尚無明確的結(jié)論。本研究旨在通過體內(nèi)外試驗探討大片形吸蟲及其ESP在不同宿主引起的巨噬細胞極化和固有免疫反應(yīng)的差異及其免疫機制，并將淋巴插管模型應(yīng)用于片形吸蟲ESP對宿主免疫細胞的作用研究，以

2、探明片形吸蟲及其ESP對宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控機制，為理解大片形吸蟲與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用提供可靠的理論基礎(chǔ)。本研究取得以下成果:
　　1.用大片形吸蟲囊蚴感染水牛、昆明小鼠(KM)和C57BL/6Nju小鼠(B6)，分別于水牛感染后4周、10周、14周和小鼠感染后3周、4周、7或8周處死。通過肝組織切片觀察到水牛和小鼠肝臟均能從炎癥浸潤向結(jié)締組織增生轉(zhuǎn)歸，水牛感染14周可見肝內(nèi)肉芽組織和成蟲形成。實時熒光定量PCR檢測肝臟枯否細胞

3、（巨噬細胞）分子標志和細胞因子mRNA表達量，并用ELISA檢測血清IFN-γ和IL-4，結(jié)果顯示:隨著感染病程的加劇水牛枯否細胞表型從M2型極化向M1、M2型共上調(diào)的趨勢轉(zhuǎn)變，KM小鼠枯否細胞表型則由前期的M1+M2混合型向M0型轉(zhuǎn)歸，而B6小鼠則表現(xiàn)為更明顯的M2型極化。結(jié)果表明:大片形吸蟲感染水牛和小鼠可誘導肝臟KC表型和細胞因子的表達變化存在較大宿主差異，這些變化的宿主差異是與不同宿主肝臟的載蟲能力、損傷修復能力、病變程度以及蟲

4、體在宿主體內(nèi)移行、發(fā)育密切相關(guān)的。
　　2.用大片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物200μg FgESP腹腔注射KM小鼠和B6小鼠，4天、7天隔日注射作為短期試驗組，14周每周注射作為長期試驗組，注射PBS為對照。通過肝組織切片觀察到FgESP腹腔短期注射不會引起小鼠肝臟明顯的組織學變化，而長期注射會導致細胞膜通透性增加、結(jié)締組織增生和纖維化趨勢。實時熒光定量PCR檢測肝臟枯否細胞（巨噬細胞）分子標志和細胞因子mRNA表達量，結(jié)果顯示:KM小鼠

5、短期注射FgESP會引起肝組織iNOS mRNA表達下調(diào)，但B6小鼠CD206、Arg-2、YM-1的表達上調(diào)，兩種小鼠枯否細胞均表現(xiàn)出M2型極化優(yōu)勢;兩種小鼠長期注射FgESP則引起完全不同的KCs表型趨勢，其中KM小鼠表現(xiàn)為M1和M2型同時上調(diào)的混合型，B6則表現(xiàn)為M1和M2均沒變化的M0型。
　　3.用200μg/mL大片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物FgESP體外刺激水牛原代BLMΦ和B6小鼠來源的傳代iPMΦ（野生型）兩類MΦ48小

6、時。實時熒光定量PCR測定兩類巨噬細胞表面分子標志和細胞因子mRNA表達量，化學法測定細胞Arg-1，Griess法測定細胞上清NO濃度，ELISA測定上清IFN-γ、IL-4濃度，結(jié)果顯示:水牛BLMΦCD68基因表達下調(diào)、Arg-2基因表達上調(diào)，Arg-1、NO的合成增加，上清中的IFN-γ濃度下降、IL-4沒有明顯變化，提示可能存在M2型極化和細胞激活的抑制或凋亡的發(fā)生;小鼠野生型iPMΦA(chǔ)rg-1合成增加，上清中的IL-4濃度顯

7、著升高，而IFN-γ、NO濃度沒有變化，也提示M2型極化。結(jié)果表明:FgESP體外刺激不同宿主MΦ均能誘導M2型極化。
　　4.用200μg/mL FgESP分別體外刺激B6小鼠來源的基因敲除iPMΦ（MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-、TLR-2/4-/-），測定上清NO、IFN-γ、IL-4濃度和細胞裂解物的Arg-1含量，并與野生型iPMΦ進行比較，結(jié)果顯示:MyD88的缺失導致IL-4的分泌與對照組無差異，而My

8、D88、TRIF同時缺失導致IL-4的分泌減少，兩者均低于野生型iPMΦ;無論是MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-還是TLR-2/4-/-iPMΦ，F(xiàn)gESP體外刺激誘導的Arg-1產(chǎn)量均與對照組無差異。結(jié)果表明:FgESP體外刺激小鼠傳代巨噬細胞能誘導依賴于MyD88及其相關(guān)通路的M2型激活，促進Th2型細胞因子分泌，促進Arg-1合成和NO分泌抑制，而TRIF和TLR2、TLR4也有可能以某種方式發(fā)揮作用。
　　5.

9、通過外科手術(shù)成功構(gòu)建綿羊的股骨前偽輸入淋巴插管、肝臟輸入淋巴插管，成功率分別為約70％和33％左右。
　　6.將200μg熒光標記的肝片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物FhESP于綿羊股骨前區(qū)域多點皮下注射（OVA設(shè)為對照抗原），并通過股骨前偽輸入淋巴插管收集0～7天不同時間點的淋巴液并分離免疫細胞，流式細胞術(shù)分析免疫細胞種類和抗原吞噬細胞的比例，熒光實時定量PCR測定巨噬細胞表面分子標志mRNA表達量，ELISA測定淋巴液的IFN-γ和IL-

10、4，結(jié)果顯示:FhESP注射刺激能使股骨前輸入淋巴中的中性粒細胞、單核細胞的比例分別在注射后4～8小時和8～12小時特異性升高，淋巴細胞的比例在注射后4～8小時特異性降低，DCs的比例在注射后4～8小時升高但與OVA對照抗原相比缺乏統(tǒng)計學差異，嗜酸性粒細胞、巨噬細胞樣細胞的比例在各時間點無明顯改變;抗原吞噬細胞的數(shù)量在注射后4～12h的短暫提高，其中，嗜酸性粒細胞、單核細胞和樹突狀細胞對FhESP的早期吞噬具有特異性，但DCs的兩個亞群

11、的比例變化不具抗原特異性;FhESP刺激能導致淋巴液分離到的細胞M2型分子標志CD206、Arg-2和YM-1的表達均在刺激后24小時內(nèi)特異性上調(diào)，淋巴液IL-4在0～8h特異性升高，IFN-γ、IL-10、IL-12的含量沒有特異性變化。結(jié)果表明:綿羊股骨前偽輸入淋巴插管操作簡單，成功率高，適用于免疫反應(yīng)動力學試驗，通過該模型我們發(fā)現(xiàn)FhESP能在綿羊體內(nèi)促進單核細胞和中性粒細胞的快速招募，提高吞噬細胞抗原吞噬能力，特異性誘導巨噬細胞

12、M2型極化和Th2細胞因子分泌。
　　綜上所述，本文認為大片形吸蟲感染導致肝臟枯否細胞表型極化趨勢和細胞免疫應(yīng)答趨勢存在較大的宿主差異，主要取決于宿主肝臟的載蟲能力、損傷修復能力和病變進程。大片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物FgESP則能在體、內(nèi)外誘導動物宿主巨噬細胞依賴于MyD88信號通路的M2型極化，并刺激分泌Th2型細胞因子，通過上調(diào)Arg-1抑制NO分泌降低巨噬細胞清除病原的能力，可能是大片形吸蟲逃避巨噬細胞免疫殺傷的策略。此外，在綿