IL-37調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化抑制宿主肝臟血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫和纖維化的機(jī)制研究.pdf

1、血吸蟲(chóng)病（Schistosomiasis）是一種嚴(yán)重危害流行區(qū)人民健康和阻礙社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的熱帶病。該病主要分布于亞洲、非洲及拉丁美洲的76個(gè)國(guó)家和地區(qū)，患病人數(shù)達(dá)2億以上。血吸蟲(chóng)病也是威脅我國(guó)人民健康的重要寄生蟲(chóng)病，截至2015年底，據(jù)推算全國(guó)共約有7.7萬(wàn)血吸蟲(chóng)病人。雖然監(jiān)測(cè)資料顯示全國(guó)血吸蟲(chóng)病疫情有下降趨勢(shì)，但血吸蟲(chóng)病流行環(huán)節(jié)復(fù)雜、影響因素眾多，我國(guó)血吸蟲(chóng)病防治工作仍面臨諸多嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，有效預(yù)防和治療血吸蟲(chóng)病仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和

2、難點(diǎn)。
　　血吸蟲(chóng)病的主要危害是蟲(chóng)卵肉芽腫病變和繼發(fā)性肝纖維化。巨噬細(xì)胞(Macrophage，M)是肉芽腫組織的主要細(xì)胞成分，也是固有免疫的重要成分，同時(shí)還作為抗原遞呈細(xì)胞啟動(dòng)并調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答，在蟲(chóng)卵肉芽腫及纖維化形成和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。雖然血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫的形成由嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞等的共同參與，但是巨噬細(xì)胞發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)顯著影響肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫和纖維化的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸

3、，從而顯著影響血吸蟲(chóng)感染后對(duì)宿主的致病及其后果。尤其M2型巨噬細(xì)胞對(duì)宿主度過(guò)血吸蟲(chóng)病急性期至關(guān)重要，若能早期抑制M1型巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化使其盡早向M2型極化，阻止炎癥重癥化，或可為臨床干預(yù)免疫炎癥導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生發(fā)展提供新的靶點(diǎn)和依據(jù)。
　　控制血吸蟲(chóng)病患者的炎癥反應(yīng)和適度抑制蟲(chóng)卵肉芽腫的形成，巨噬細(xì)胞正是一個(gè)理想的靶向目標(biāo)。已有研究提示，巨噬細(xì)胞的極化過(guò)程是可逆的，巨噬細(xì)胞的表型和功能的改變可能受局部一些細(xì)胞因子環(huán)境調(diào)控。只是

4、目前在蟲(chóng)卵肉芽腫和纖維化發(fā)生發(fā)展的不同時(shí)期，到底是哪些因素觸發(fā)巨噬細(xì)胞的表型和功能發(fā)生變化，尚未見(jiàn)系統(tǒng)深入的研究。全面了解血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫和纖維化發(fā)生發(fā)展中巨噬細(xì)胞的表型及功能改變?cè)颍缙谝种?M1型巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化并/或使其盡早向M2型極化，阻止炎癥重癥化，將為減輕或抑制肉芽腫炎癥反應(yīng)和肝纖維化提供新的思路。
　　白細(xì)胞介素-37（Interleukin-37，IL-37）是IL-1家族的新成員，又被稱為IL-1F7。IL-

5、37是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種能夠調(diào)節(jié)固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，在各種炎性疾病和免疫性疾病中具有抑制炎癥作用。IL-37在可多種細(xì)胞中表達(dá)，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、組織上皮細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、腺細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等。成熟的IL-37可分泌到細(xì)胞外與細(xì)胞表面SIGIRR和IL-18Rα兩個(gè)受體亞基結(jié)合通過(guò)受體途徑進(jìn)行免疫負(fù)調(diào)控作用；另外成熟的IL-37還可進(jìn)入A549細(xì)胞和THP-1細(xì)胞的細(xì)胞核，與Sm

6、ad3蛋白相互作用，通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子途徑抑制免疫應(yīng)答。以往研究表明IL-37對(duì)巨噬細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，但I(xiàn)L-37是否影響巨噬細(xì)胞的極化以及作用機(jī)制目前尚未報(bào)道。
　　我們推測(cè)在血吸蟲(chóng)感染時(shí)，IL-37可能抑制M0極化為M1型巨噬細(xì)胞并介導(dǎo)M0較早向M2極化，從而抑制或減輕蟲(chóng)卵肉芽腫引起的宿主過(guò)度的炎癥反應(yīng)，使宿主順利度過(guò)血吸蟲(chóng)感染急性期反應(yīng)并減輕后期肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。
　　由于市售的IL-37細(xì)胞因子的設(shè)計(jì)沒(méi)有體現(xiàn)其轉(zhuǎn)

7、錄因子的作用，該細(xì)胞因子的成藥性可能被低估，而且不能從轉(zhuǎn)錄因子角度研究IL-37。為了深入研究IL-37如何抑制宿主血吸蟲(chóng)肝纖維化的作用及其機(jī)制，本課題組主要成員美國(guó)Antagen制藥有限公司研發(fā)總監(jiān)及我校兼職教授高聞達(dá)自主設(shè)計(jì)并制備了轉(zhuǎn)染人CPP-IgG2Fc-IL-37的CHO細(xì)胞株和no CPP-IgG2Fc-IL-37的CHO細(xì)胞株。通過(guò)該兩株細(xì)胞的培養(yǎng)，得到并純化出真核細(xì)胞表達(dá)的 CPP-IgG2Fc-IL-37和 no CP

8、P-IgG2Fc-IL-37蛋白。其中 hIL-37為人 IL-37蛋白；CPP為細(xì)胞穿透肽（cell-penetrating peptide，CPP），有助于蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用；帶有IgG2Fc mut是為了避免產(chǎn)生ADCC或者CDC，延長(zhǎng)IL-37蛋白的體內(nèi)半衰期并有利于蛋白純化；同時(shí)還在CPP-IL-37和IgG2Fc之間設(shè)計(jì)了帶有WEHD氨基酸序列的caspase-1酶切位點(diǎn)。這樣CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白可從細(xì)胞

9、外通過(guò)CPP的作用轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞后，在caspase-1作用下使IL-37脫離IgG并能將IL-37遞送至細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能。也就是說(shuō) CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白既能遞送細(xì)胞表面信號(hào)又能遞送細(xì)胞內(nèi)及核因子信號(hào)。而no CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白因?yàn)闆](méi)有細(xì)胞穿透肽，也沒(méi)有蛋白酶切割位點(diǎn)，因此 no CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白僅與細(xì)胞表面 IL-37受體結(jié)合而活化該受體信號(hào)通路。IL-37蛋白

10、帶有CPP及Ig融合蛋白的原創(chuàng)性設(shè)計(jì)，其通過(guò)細(xì)胞表面膜受體或兼具核轉(zhuǎn)錄因子通路的作用機(jī)制能夠被充分研究。
　　為了進(jìn)一步確認(rèn) IL-37是否能夠通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變從而改善宿主肝臟血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫和肝纖維化的作用及其機(jī)制，本研究分為3個(gè)部分：一、檢測(cè)血吸蟲(chóng)急性感染病人和正常人血清中IL-37的表達(dá)情況，初步探討IL-37是否與血吸蟲(chóng)感染具有相關(guān)性；二、利用 C57BL/6小鼠制備日本血吸蟲(chóng)感染模型，在感染后24天始分別給予重組

11、 IL-37(Recombinant IL-37, rIL-37)蛋白、CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白(以下簡(jiǎn)寫(xiě)為CPP-IL-37)和no CPP-IgG2Fc-IL-37(以下簡(jiǎn)寫(xiě)為no CPP-IL-37)直至第6周，研究IL-37是否通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變抑制宿主血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫形成及肝纖維化發(fā)展；三、在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，分別加入rIL-37蛋白、no CPP-IL-37蛋白、CPP-IL

12、-37蛋白及Smad3抑制劑SIS3等共培養(yǎng)，探討該IL-37蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞向M1/M2極化的影響，并探討IL-37對(duì)巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制。
　　一、檢測(cè)血吸蟲(chóng)急性感染病人和正常人血清中IL-37的表達(dá)情況
　　IL-37在炎性疾病和自身免疫性疾病的致病中扮演重要角色，且IL-37的表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)收集14份日本血吸蟲(chóng)急性感染病人血清和14份非流行區(qū)健康人血清，雙抗夾心ELISA檢測(cè)各組血清中IL-37

13、的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照組低表達(dá)IL-37，而急性日本血吸蟲(chóng)感染患者血清中IL-37的表達(dá)量明顯升高（p<0.05）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 IL-37作為一種抗炎性細(xì)胞因子，可能通過(guò)某種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制抑制炎癥因子，與血吸蟲(chóng)病的發(fā)病及病程進(jìn)展存在一定關(guān)系，可能在血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫反應(yīng)中起到抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)、保護(hù)宿主機(jī)體的作用。
　　二、觀察IL-37處理后對(duì)小鼠肝臟血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫和肝纖維化的影響
　　為了進(jìn)一步明確 IL-37在

14、日本血吸蟲(chóng)感染小鼠肝臟肉芽腫和肝纖維化病變中的作用，小鼠血吸蟲(chóng)感染后第24d開(kāi)始通過(guò)尾靜脈注射分別給予合適劑量的rIL-37、no CPP-IL-37或CPP-IL-37蛋白，每隔3d一次，于感染后42天剖殺小鼠，觀察血吸蟲(chóng)感染小鼠經(jīng)IL-37治療后對(duì)處理肉芽腫炎癥反應(yīng)和肝纖維化的影響；并采用HE染色、Masson染色、qRT-PCR、FACS及免疫組化等技術(shù)從細(xì)胞、分子水平分析其機(jī)制。
　　結(jié)果顯示：不同劑型的IL-37蛋白處理

15、后對(duì)感染小鼠的蟲(chóng)荷、卵荷、肝臟重量沒(méi)有明顯影響。但肉眼可見(jiàn)IL-37處理組小鼠肝臟大體外觀明顯改善，肝臟表面蟲(chóng)卵結(jié)節(jié)減少；尤以CPP-IL-37蛋白治療組肝臟外觀改善最明顯。HE染色結(jié)果顯示不同劑型的IL-37蛋白處理組小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫中浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞明顯減少，肝細(xì)胞壞死明顯減輕，與感染對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)IL-37處理組小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫面積明顯減小(p<0.05）；尤以CPP-IL-37蛋白處理組肉芽腫面積減小最為明顯，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后

16、三種不同的 IL-37處理組之間肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫面積差異沒(méi)有顯著性（p>0.05）。不同劑型的IL-37蛋白處理組小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT水平均明顯低于感染對(duì)照組(p<0.05)；其中CPP-IL-37蛋白和no CPP-IL-37蛋白處理組肝功能損害減輕最為明顯，rIL-37蛋白處理組肝功能損害恢復(fù)程度不如no CPP-IL-37蛋白和CPP-IL-37蛋白處理組(p<0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同劑型的IL-37蛋白處理組與感染對(duì)照組

17、相比，肝臟膠原纖維的間隔減少并變細(xì)（p<0.05）；其中CPP-IL-37蛋白處理組的纖維化面積減少最為明顯，IL-37蛋白處理組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接著我們通過(guò)免疫組化利用 anti-α-SMA多抗檢測(cè)各組小鼠肝臟α-SMA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)不同劑型的IL-37蛋白處理后α-SMA蛋白的表達(dá)量比感染對(duì)照組顯著減少(p<0.05）；其中CPP-IL-37蛋白處理組α-SMA的表達(dá)減少最為明顯，三種IL-37蛋白處理組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

18、。而且不同劑型的IL-37蛋白處理組后與感染對(duì)照組相比小鼠肝臟組織中IL-17的 mRNA明顯下調(diào)，而TGF-β的 mRNA水平明顯上調(diào)(p<0.05）；更感興趣的是巨噬細(xì)胞M1細(xì)胞因子iNOS的mRNA水平也明顯下調(diào)，而巨噬細(xì)胞 M2細(xì)胞因子 Fizzl的 mRNA水平高于感染對(duì)照組(p<0.05）。FACS分析顯示不同劑型的IL-37蛋白處理后與感染對(duì)照組相比肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫細(xì)胞中 Treg細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞比例明顯多于感染組（p<0.05

19、）；Th2細(xì)胞有所增多，而Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞有所減少，但感染鼠各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CPP-IL-37處理組 Treg細(xì)胞的比例顯著高于其他 IL-37治療組(p<0.05）。FACS分析同時(shí)還顯示不同劑型的IL-37蛋白處理后與感染對(duì)照組相比，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞比例明顯增多（p<0.05），經(jīng) CPP-IL-37蛋白處理后 M2比例升高的最多(p<0.01)。
　　以上結(jié)果揭示 IL-3

20、7通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向 M2極化進(jìn)而影響其下游效應(yīng)細(xì)胞（Th細(xì)胞）功能從而抑制血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫反應(yīng)和肝臟纖維化，保護(hù)宿主肝臟功能。
　　三、探討IL-37誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2極化的作用機(jī)制
　　為了探究IL-37誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型向M2轉(zhuǎn)變的機(jī)制，在體外分離和培養(yǎng)正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（M0），分別用100ng/ml的 rIL-37、20ng/ml的 no CPP-IL-37蛋白、10ng/ml的CPP-IL-37蛋白或10ng/m

21、l的 CPP-IL-37蛋白+2μΜ的 SIS3與M0共培養(yǎng)12h。因CPP-IL-37蛋白帶有CPP，有助于IL-37蛋白進(jìn)入細(xì)胞及細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，為了觀察CPP-IL-37蛋白作為核轉(zhuǎn)錄因子的作用，在該實(shí)驗(yàn)中加入Smad3的特異性抑制劑SIS3。FACS結(jié)果顯示不同劑型的IL-37蛋白作用于M0后，M0極化為M2的細(xì)胞比例與PBS對(duì)照組相比均明顯增多（p<0.01）；其中CPP-IL-37蛋白處理組誘導(dǎo)為 M2型巨噬細(xì)胞的比例最大

22、，與其他三組相比差異具有顯著性（p<0.05）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明 IL-37可通過(guò)細(xì)胞表面受體信號(hào)通路及核轉(zhuǎn)錄因子途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2極化。但M0預(yù)先用不同濃度的Compound C（AMPK抑制劑）處理后，CPP-IL-37蛋白誘導(dǎo)M0為M2的比例隨著AMPK抑制劑濃度的增加逐步下降。免疫印跡結(jié)果顯示用rIL-37、no CPP-IL-37和CPP-IL-37蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞12h后，pAMPK蛋白的表達(dá)均明顯提高（p<0.01），尤

23、其 CPP-IL-37蛋白處理組 pAMPK蛋白的表達(dá)量最高（p<0.01），經(jīng) SIS3抑制后 pAMPK的表達(dá)量與rIL-37和no CPP-IL-37蛋白處理組基本相似（p>0.05）。說(shuō)明IL-37能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)AMPK的活化，活化的AMPK能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化，從而調(diào)控機(jī)體過(guò)度的炎癥反應(yīng)。
　　總之，本研究首次描述了IL-37在急性血吸蟲(chóng)感染患者的血清中含量明顯升高；C57BL/6小鼠感染日本血吸蟲(chóng)后，經(jīng)IL-

24、37處理后小鼠的肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫和肝纖維化程度明顯減輕，小鼠肝臟和腹腔M2型巨噬細(xì)胞的比例明顯增多；體外實(shí)驗(yàn)用IL-37誘導(dǎo)正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M2的極化的比例也明顯增多，同時(shí)IL-37處理后明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)AMPK的活化，Smad3能增強(qiáng)IL-37的抑炎功能。本研究還首次證明我們制備的CPP-IL-37蛋白使用較低的工作濃度卻發(fā)揮了更好的作用效果。擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的no CPP-IL-37和CPP-IL-37蛋白不僅便于本課題的實(shí)施