梅毒患者外周血單個(gè)核細(xì)胞microRNA表達(dá)譜檢測(cè)及其靶基因功能預(yù)測(cè)分析.pdf

1、背景：
　　梅毒是由梅毒螺旋體感染引起的慢性、性傳播疾病。梅毒螺旋體能夠侵襲人體全身多個(gè)器官和系統(tǒng)，給患者帶來(lái)巨大傷害。二期梅毒為梅毒螺旋體感染的急性期，會(huì)出現(xiàn)皮疹、脫發(fā)、粘膜斑、全身淋巴結(jié)腫大，甚至出現(xiàn)內(nèi)臟、眼和神經(jīng)系統(tǒng)損害等;梅毒螺旋體感染會(huì)侵犯骨骼、心血管、中樞神經(jīng)等系統(tǒng)，引起被侵犯器官的不可逆性損害。侵犯神經(jīng)中樞系統(tǒng)引起的神經(jīng)梅毒帶來(lái)的危害巨大，而目前對(duì)于其診斷仍然存在挑戰(zhàn)，值得關(guān)注。很多研究表明miRNAs在多種疾病的發(fā)

2、生發(fā)展中有重要調(diào)控作用，并在疾病的診斷以及預(yù)后中有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，沒(méi)有關(guān)于梅毒患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA表達(dá)譜及其臨床應(yīng)用的報(bào)道。本研究采用miRNA芯片檢測(cè)二期梅毒和神經(jīng)梅毒患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的miRNAs表達(dá)譜，篩選出若干差異表達(dá)顯著的miRNAs，并通過(guò)real-time qPCR技術(shù)驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，為深入研究miRNAs在梅毒的發(fā)病機(jī)制中的作用以及進(jìn)一步研發(fā)miRNAs作為神經(jīng)梅毒的診斷標(biāo)記物奠定基礎(chǔ)。
　　

3、目的：
　　探討miRNAs在梅毒感染中的調(diào)控作用及在其分子分型中的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：
　　1.采用miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)8例二期梅毒患者、6例神經(jīng)梅毒患者和5例健康體檢者的外周血單個(gè)核細(xì)胞的miRNAs的差異表達(dá)，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)篩選出顯著差異表達(dá)的miRNAs;
　　2.采用美國(guó)ABI公司設(shè)計(jì)合成的miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物和表達(dá)分析探針，通過(guò)Real-time qPCR方法在30例正常人、31例二

4、期梅毒和33例神經(jīng)梅毒患者中驗(yàn)證芯片篩選的差異表達(dá)的miRNAs，鑒定芯片的可靠性;
　　3.通過(guò)targetscan、miRDB、RNA22三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNAs的靶基因，并選擇三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共同支持的靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG pathway分析，為深入研究其生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)microRNA基因芯片檢測(cè)三組樣本中miRNAs表達(dá)譜，以及生物信息差異基因分析和聚類分析共篩選

5、出39條在神經(jīng)梅毒中顯著差異表達(dá)的miRNAs(P＜0.05)，其中18條miRNAs上調(diào)，21條miRNAs下調(diào)，二期梅毒中此39條miRNAs表達(dá)水平介于兩者之間，提示可能存在特異性的miRNA可以作為診斷神經(jīng)梅毒的分子標(biāo)記物;
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證13條差異表達(dá)的miRNAs，13條差異表達(dá)的miRNAs表達(dá)趨勢(shì)在各組之間與芯片結(jié)果一致，因此芯片結(jié)果的驗(yàn)證率為100％，芯片結(jié)果具有較高的可靠性;
　　3.利用

6、targetscan、miRDB和RNA22三個(gè)miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶基因，取靶基因交集后發(fā)現(xiàn)39條miRNAs共有靶基因5489個(gè);
　　4.對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行GO分析后發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控的靶基因在生物進(jìn)程上主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA代謝過(guò)程調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白結(jié)合、細(xì)胞凋亡、程序性死亡等過(guò)程;而在細(xì)胞組成上，靶基因主要定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器等部位;其參與的分子功能主要集中于金屬離子的結(jié)合、核苷酸分子的

7、結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的激活等方面;
　　5.針對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行KEGG pathway分析后，發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控的靶基因主要參與細(xì)胞凋亡、B細(xì)胞信號(hào)通路、內(nèi)吞作用、焦點(diǎn)粘連、白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移通路、趨化因子信號(hào)通路、T細(xì)胞信號(hào)等通路;
　　6.預(yù)測(cè)miR-21-3p靶基因參與機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路，下調(diào)機(jī)體免疫，推測(cè)其在梅毒感染過(guò)程中協(xié)助梅毒螺旋體的長(zhǎng)期潛伏，形成慢性感染。
　　結(jié)論：
　　本研究通過(guò)miRNA

8、芯片技術(shù)在二期梅毒和神經(jīng)梅毒患者PBMC中篩選出39條差異表達(dá)的miRNAs，并且通過(guò)熒光定量PCR探針?lè)〝U(kuò)大檢測(cè)臨床樣本后驗(yàn)證芯片結(jié)果具有較高的可靠性;39條差異表達(dá)的miRNAs在三組之間差異明顯，可以有效區(qū)分神經(jīng)梅毒，提示miRNAs可能可以用于梅毒的分子分型，為進(jìn)一步尋找外周血的miRNAs作為神經(jīng)梅毒的診斷和預(yù)后的標(biāo)記物奠定了重要基礎(chǔ);生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了了差異表達(dá)的miRNAs靶基因，并分析其潛在的生物學(xué)功能及相關(guān)的分子機(jī)制。初