NKG2D、NKG2A受體陽性NK-92細(xì)胞系的克隆篩選及其功能研究.pdf

1、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的發(fā)現(xiàn)是一次偶然的機(jī)遇，源于免疫學(xué)家對(duì)荷瘤小鼠腫瘤特異性細(xì)胞體外活性的研究。該研究以正常未免疫小鼠和非相關(guān)腫瘤抗原免疫小鼠作為陰性對(duì)照，在檢測(cè)抗原特異性淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤特異抗原的免疫應(yīng)答時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組也表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞明顯的殺傷效應(yīng)。對(duì)照組的這種非特異性殺傷證實(shí)存在一種不同于T，B淋巴細(xì)胞的大顆粒淋巴細(xì)胞，因其具有天然殺傷活性而被命名為自然殺傷細(xì)胞，占外周血淋巴細(xì)胞的10％-15％。NK細(xì)胞主要表現(xiàn)為抗病毒、抗腫瘤

2、效應(yīng)。 雖然NK細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的一種，但是它不表達(dá)抗原特異性的受體，是天然免疫系統(tǒng)中的重要一員。盡管NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在殺傷機(jī)制方面有相似之處，但前者在很多方面仍不同于后者。主要表現(xiàn)為：NK細(xì)胞不表達(dá)特異性的T細(xì)胞受體和CD3分子；NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別不受MHC的限制；NK細(xì)胞不形成免疫記憶。 為了更深入地研究NK細(xì)胞的識(shí)別、增殖、分化和殺傷機(jī)制，免疫學(xué)家建立了NK細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系。然而，分離純化NK細(xì)胞的技術(shù)尚存

3、在一定的困難。而NK細(xì)胞系的建立則為NK細(xì)胞基礎(chǔ)研究提供了良好的工具。目前，已建立了六種NK細(xì)胞系(YT,NK-92,NKL，HANK-1，KHYG-1，NK-YS)，其中NK-92細(xì)胞系的引起科學(xué)家更多的關(guān)注。NK-92來源于一個(gè)非霍奇金淋巴瘤患者，表型為CD2+CD3-CD4-CD8-CD16-CD56bright，生長依賴于細(xì)胞因子IL-2。國外同行已經(jīng)將NK-92用來研究NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)機(jī)制，并闡明p58和p70殺傷抑制

4、性受體的特異性及CD94和NKG2A的關(guān)系。 NK細(xì)胞表面存在激活性受體和抑制性受體。多年來，NK細(xì)胞識(shí)別非我并區(qū)分自我的機(jī)制困惑了許多免疫學(xué)家。而兩種NK細(xì)胞不同活性受體的確認(rèn)使這一問題有了比較滿意的解答。抑制性受體包括KIR家族和NKG2A，NKG2A是凝集素家族NKG2系列的典型的抑制性受體的代表，在人類，其配體為HLA-E分子；激活性受體包括NKp44,NKp30,NKp46和NKG2D，NKG2D大概是目前與和細(xì)胞窘迫

5、反應(yīng)(包括轉(zhuǎn)化，感染和細(xì)胞壓力等)相關(guān)的最具特征性的一種激活性受體。主要表達(dá)于活化的CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和γδT細(xì)胞等。在人類，其配體主要為MICA，MICB，ULBP-1，ULBP-2，ULBP-3和ULBP-4。至于NK細(xì)胞表面膜結(jié)合型受體誘導(dǎo)活化的機(jī)制仍不是非常清楚，有待進(jìn)一步研究。 NKG2D作為一種重要的激活性受體，在某些情況下可逾越抑制性信號(hào)的抑制，直接激活NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。該研究為了進(jìn)一步揭示激活性受體N

6、KG2D的作用機(jī)制，探討激活性受體與抑制性受體之間的相互作用關(guān)系，以NK-92和NK-92IL-15(IL-15基因修飾的NK-92，本室構(gòu)建)作為研究對(duì)象，擬應(yīng)用有限稀釋法克隆培養(yǎng)，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀篩選NKG2D、NKG2A表達(dá)陽性細(xì)胞，擬從中篩選出三種細(xì)胞模型—NKG2A單表達(dá)、NKG2D單表達(dá)和NKG2A、NKG2D共表達(dá)細(xì)胞株，并應(yīng)用抗體阻斷實(shí)驗(yàn)研究NKG2D激活性受體介導(dǎo)的殺傷功能。 方法: (1)有限稀釋法克

7、隆培養(yǎng)。NK-92細(xì)胞、NK-92IL-15細(xì)胞以100ul/孔，按照每孔一個(gè)細(xì)胞的濃度加入96孔中，無需輔助細(xì)胞參與。 (2)RT-PCR和FACS檢測(cè)NKG2D、NKG2A和NKG2D配體MICA的表達(dá)。 (3)利用熒光顯微鏡檢測(cè)NK-92細(xì)胞、NK-92IL-15細(xì)胞表面NKG2D和NKG2A的表達(dá)水平。 (4)穿膜FACS和Western-blot檢測(cè)細(xì)胞胞漿內(nèi)NKG2D表達(dá)水平。 (5)MTT比

8、色法檢測(cè)NK-92和NK-92IL-15細(xì)胞對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞系M21的殺傷。 結(jié)果: 一、不同培養(yǎng)基、不同濃度IL-2和IL-15對(duì)NK-92亞克隆形成的影響(1)利用完全新鮮培養(yǎng)基和等體積新鮮培養(yǎng)基與細(xì)胞培養(yǎng)上清混合培養(yǎng)時(shí)，后者在不同濃度IL-2或IL-15刺激下，表現(xiàn)出比前者略高的克隆成活百分率，但二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(2)IL-2和IL-15聯(lián)合刺激的NK-92細(xì)胞系和IL-2單獨(dú)刺激的NK-92IL-15細(xì)胞系的克

9、隆成活率并無明顯差別。大約在10天左右即可見圓亮、集群的克隆形成。 二、不同NK-92和NK-92IL-15亞克隆NKG2D、NKG2A的表達(dá)水平應(yīng)用RT-PCR、Western-blot、穿膜FACS和膜表面FACS在mRNA、胞漿蛋白以及胞膜蛋白三個(gè)不同水平，檢測(cè)NKG2D和NKG2A的水平。RT-PCR結(jié)果表明NKG2D和NKG2A無論在NK-92還是在NK-92IL-15都有明顯的mRNA轉(zhuǎn)錄，二者轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度并無明顯區(qū)別；

10、在兩種細(xì)胞系中，應(yīng)用Western-blot都不能檢測(cè)到其蛋白水平的表達(dá)，而應(yīng)用穿膜FACS和膜表面FACS，雖然在NK-92檢測(cè)不到NKG2A、NKG2D的表達(dá)，但是在NK-92IL15卻能檢測(cè)到NKG2D的低表達(dá)，NKG2A則和在NK-92細(xì)胞中一樣沒有表達(dá)。 三、MICA在黑素瘤細(xì)胞系M21細(xì)胞的表達(dá)水平RT-PCR檢測(cè)M21細(xì)胞內(nèi)NKG2D配體MICA，ULBP-1，ULBP-2和ULBP-3的轉(zhuǎn)錄水平，其中MICA在這

11、幾種配體中表達(dá)強(qiáng)度最高。FACS檢測(cè)M21細(xì)胞表面MICA分子呈低水平的表達(dá)。 四、NKG2D抗體阻斷對(duì)NK-92和NK-92IL-15細(xì)胞殺傷活性的影響應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)IL-15基因修飾的NK-92細(xì)胞(NK-92IL-15)和NK-92細(xì)胞對(duì)黑素瘤細(xì)胞系M21細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)顯示，NK-92IL-15表現(xiàn)出更高的殺傷效應(yīng)。應(yīng)用NKG2D抗體阻斷NK-92IL-15細(xì)胞表面激活性受體NKG2D后，發(fā)現(xiàn)其殺傷效應(yīng)有明顯的降低，